基本方案 温和去垢剂裂解法（对非贴壁细胞）

实验前准备具体见其他：

1. 培养待标记的细胞至适当的生长期。

生长旺盛的细胞中磷酸盐转运达到最高峰，除非研究静止期细胞的蛋白质磷酸化，一般待标记的细胞生长密度应低于最大密度，标记前 3～18 h 换新鲜的培养液培养将有利于标记。

2. 1800 g 离心 1 min，吸去培养上清，将细胞用含血清不加标记物的标记培养液重悬，再次离心吸去培养液。

3. 每 10⁷ 细胞加入 2 ml 标记培养基，转移至适合大小的培养平皿。

4. 在树脂玻璃挡板后操作，使用配备塞有棉花防浮质吸管的微量移液器加入 ³²P 至终浓度为 0.1～2 mCi/ml。

标记 1～2 h 已足够，但细胞可在 6 h 内耐受高达 2 mCi/ml 和在 18 h 内耐受低浓度（0.1～0.5 mCi/ml）的辐射。

5. 将培养皿置于预热的树脂玻璃盒中，并将盒子置于培养箱中。

6. 标记结束时，将装有标记细胞的树脂玻璃盒移至冷室，放在树脂玻璃挡板后面。

7. 从树脂玻璃盒子中取出培养皿，将细胞移至带螺口盖的微量离心管中，1800 g 离心 1 min 回收细胞，吸尽培养液。

8. 细胞用小体积的冷 TBS 重悬，移至带螺口盖微量离心管中，1800 g 离心 1 min，吸尽 TBS。

9. 每 10⁷ 细胞用 0.5～1 ml 裂解缓冲液悬浮细胞，用一次性的巴斯德吸管轻轻混匀， 4℃ 放置 20 min。

10. 盖上管盖，于 4℃ 26000 g离心30 min澄清裂解液。

11. 离心后，将上清（裂解物）移至新离心管中，离心管和沉淀作为同位素污物处理。

12. 用凝胶电泳、免疫沉淀或蛋白质纯化方法，分析标记的裂解液，所有过程均在 4℃ 适当屏蔽下进行。

1. 管内液体最好是装至半满以防液体溅出。

2. 用 RIPA 缓冲液制备裂解液时，由于细胞核的溶解常导致细胞裂解液变得黏稠。当发生这种情况时，延长离心时间到 90 min，或离心前在 RIPA 液中加入 50 μl 固相化金黄色葡萄球菌，都可使 DNA 沉于管底。

3. 除非特别说明，细胞培养在加湿的 37℃，10% CO₂ 培养箱

试剂：

标记培养液：不含磷酸盐的细胞培养液 （如DMEM），添加了常规浓度的血清或用无磷酸盐的盐水透析过的血清，37℃

溶于 HCl 中的 1 Ci/ml H₃³²PO₄ （无载体，ICN）

Tris 平衡盐水（TBS） 或磷酸盐平衡盐水（PBS），冰冷

温和裂解缓冲液或 RIPA 裂解缓冲液

仪器：

1 in 厚的树脂玻璃挡板

塞有滤芯的防浮质的取液器吸头

树脂玻璃盒，预热到 37℃

带螺口盖的微量离心管

一次性的吸管（塞有棉花）

橡皮细胞刮子

Sorvall 冷冻离心机，带 SM 24 转子和橡皮套管，或其他相当的冷冻离心机，4℃

树脂玻璃薄板 （10 in × 10 in × 1/4 in） 或树脂玻璃管架，4℃