基本方案

实验试剂仪器的具体要求和准备见「其他」。

1. 用 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离含有 ³²P 标记的蛋白质样品。

2. 电泳后，干胶，四周边缘用荧光墨水标记，对 X 射线胶片曝光（放射自显影）。

3. 通过与胶片上的凝胶四周荧光标记的位置的比对确定蛋白质的位置。将胶片与干胶钉在一起，胶片朝下放入一个光盒里。在胶的背面用软铅笔或圆珠笔（不要用标签笔）标记出 32P 标记蛋白质条带的位置。

4. 将干胶与胶片分离开，用单边剃刀刀片从胶上割下蛋白质条带。从割下的胶条上剥去纸片并用刀片轻轻刮去残留的纸屑。尽量不要削掉凝胶，因为这会减少蛋白质的回收。将胶条放到 1.7 ml 带螺旋盖的微量离心管中，用闪烁计数器进行契仑科夫计数以测定放射量。

5. 将干的胶条重新浸入 500 μl 50 mmol/L 碳酸氢铵，pH 7.3～7.6 中，于室温下放置 5 min。用 Kontes 组织研磨杵捣碎胶条，直至管子对着光看不到胶块时为止。加入 500 μl 50 mmol/L 碳酸氢铵，pH 7.3～7.6，10 μl 2-巯基乙醇和 10～20% SDS，煮 2～3 min。

6. 在摇床上于室温下摇荡 4 h 或于 37℃ 至少摇荡至少 90 min 以提取蛋白质。

7. 用带吊桶式转子的台式离心机于室温下 500 g 离心 5 min 收集管底的凝胶浆。上清移至新的 1.5 ml 微量离心管中。

8. 在开始第二次洗脱前，测量第一次洗脱液的体积并计算出第二次洗脱的液体量，以使两次洗脱液合并在一起的总量约为 1300 μl。第二次洗涤时，按计算出的量加入 50 mmol/L 碳酸氢铵，内含 0.1% SDS 和 1.0% 2-巯基乙醇。涡旋振荡，煮 2～3 min，然后在摇床上孵育至少 90 min 进行再次提取。

9. 按照步骤 7 的方法离心分离凝胶和洗脱液，将上清液转移到装有初次洗脱液的管子中。

10. 为了除尽合并的洗脱液中的凝胶浆，全速离心 5～10 min，将上清液转移到新的管子中。在丢弃凝胶碎片前，用契仑科夫计数法进行检测以确保有 60%～90% 的 ³²P 标记蛋白被回收。

11. 将洗脱液放置在冰上冷却。加入 20 μg 载体蛋白（10 μl 2 mg/ml 的储液），充分混匀，加入 250 μl 冰冷的 100% TCA，充分混匀，冰上孵育 1 h。

12. 于 4℃ 全速离心 5～10 min 收集蛋白质沉淀。弃上清液，再次于 4℃ 离心 3 min，去除残留的 TCA。

13. 加入 500 μl 冰冷的 96% 乙醇颠倒管子几次洗涤 TCA 沉淀，于 4℃ 全速离心 5 min，弃上清液，再次于 4℃ 离心 3 min，去除残留液体。晾干蛋白质沉淀（不要冻干）。

14. 用契仑科夫计数法对沉淀进行检测以确保大部分的 ³²P 标记蛋白被回收。

此时样品的 cpm 值应当与洗脱液（见步骤 10）的 cpm 值相同或稍微高一些，因为洗脱液的液体会碎灭减少计数。

15. 制备过甲酸：将 9 份甲酸与 1 份 30% 过氧化氢混合，于室温下孵育 60 min。将过甲酸放置于冰上冷却。

16. 将 TCA 沉淀的蛋白质重悬于 50 μl 冰冷的过甲酸中，冰上孵育 60 min。

17. 加入 400 μl 去离子水，混匀，放置于干冰上冷冻。在 SpeedVac 蒸发器中真空蒸发掉过甲酸。

18. 将蛋白质沉淀重溶于 50 μl 50 mmol/L 碳酸氢铵，pH 8.0, 加入 10 μg 胰蛋白酶（10 μl 1 mg/ml 的储液）， 37℃ 消化 3～4 h 或过夜。

19. 再加入 10 μg 胰蛋白酶，再次于 37℃ 消化 3～4 h 或过夜。

20. 加入 400 μl 去离子水，在 SpeedVac 蒸发器中冻干。将干粉重溶于 400 μl 去离子水中并再次冻干。如此重复，至少要冻干 4 次。

21. 将胰蛋白酶消化的产物重溶于 400 ul 电泳缓冲液或去离子水中。

22. 全速离心 5～10 min 去除肽混合溶液中的颗粒物质，将上清液转移到一个新的微量离心管中，冻干。用契仑科夫计数法测量最终样品的 ³²P 放射量。

23. 用至少 5 μl 的 pH 1.9 的电泳缓冲液、pH 4.72 的电泳缓冲液或去离子水，重新溶解消化产物，全速离心 2～5 min 收集管底的样品溶液。

24. 用超软的钝头铅笔在 TLC 平板的纤维素侧划小叉标记出样品和染料起始点（图 17.9.1），注意不要扰动纤维素层（或者也可以选择在反面用记号笔做标记）。

25. 用装有长而柔韧吸头（圆的，凝胶上样吸头很好用）的小体积可调移液器，将各个样品（1000 cpm）点到相应的起始点上。每滴点 0.2 ～0.5 μl，吹干后再点下一滴，可以用带滤器（滤掉浮质及颗粒物质）的气管和 1 ml 注射器或巴斯德吸管吹干所点的样品。

26. 在板的顶端的染料起始点上滴加 0.5 μl 绿色标记液（图 17.9.1 和图 17.9.2）。

27. 如下准备 HTLE 7000 装置，参见图 17.9.3。

27.1 将电泳缓冲液倒入缓冲液缸中，约 5 cm 深。在 Teflon 盖子上放一张聚乙烯膜以保护并隔绝底座，膜的两端折下塞入底座和缓冲液缸之间，将膜固定。

27.2 在电泳缓冲液中浸湿电泳芯子，将芯子的一边塞入缓冲液缸中，折起另一边放在底座上的聚乙烯膜上。再取一张聚乙烯膜放于底座、电泳芯子和部分缓冲液缸上。

27.3 在顶上放第二张 Teflon 膜和氯丁橡胶垫，封闭装置，用两个销子固定盖子。将气压调至 10 psi 使气袋膨胀以从电泳芯子中挤出多余的缓冲液。保持气压直到开始电泳为止。

27.4 当样品点到 TLC 平板（步骤 25 和 26）并准备开始电泳时，关闭气压并打开装置。除去氯丁橡胶垫和顶端的 Teflon 膜及聚乙烯膜，折回电泳芯子。用绵纸擦干两张聚乙烯膜。

27.5 按照图 17.9.2 浸湿含有样品的 TLC 平板并将之放于覆盖底座的聚乙烯膜上。将两侧的电泳芯子分别盖在平板的边上约 1 cm 宽，然后按照上述操作小心地重新搭好装置。聚乙烯膜与 TLC 板接触后，要避免其侧移。用销子固定盖子，使气袋膨胀至 10 psi , 打开冷却水流，开始电泳。

27.6 以 1.0 kV 电压电泳 20～30 min，在一维方向上分离肽（图 17.9.2）。

28. 电泳完成后，拆除装置，用风扇吹干 TLC 平板，至少吹 30 min。

29. 在平板的左手边或右手边的边缘与样品起始点齐平的位置点上一滴（约 0.5 ml） 绿色标记染料，避免滴加到被电泳芯子接触挤压过的区域（图 17.9.4）。将干的平板近乎竖直地放置到装有合适的层析缓冲液的层析缸中，盖上盖子。在层析进行时切勿扰动层析缸或打开盖子。使缓冲液跑到距离平板顶端 1～2 cm 处。

30. 打开层析缸，将 TLC 平板从层析缸中取出。使平板在通风橱中干燥 1 h 或在 65℃ 烘箱中干燥 15 min。

31. 用荧光墨水在平板四周做标记，这些参照标记有助于以后的放射自显影图片与TLC 平板的比对。在增感屏的辅助下将平板对 X 射线胶片或磷屏曝光以进行放射自显影。如果需要回收肽以备进一步的分析的话，参见辅助方案。

1. 特别注意：管子的品牌非常重要。应当选用不会产生副作用或在最后转移一步中吸附太多 cpm 的管子。作者使用的是 Myriad Industries 的微量离心管。

2. 步骤 17 中，非常重要的一点是稀释并冷冻后再进行蒸发，否则，SpeedVac 蒸发器中温度的升高会使样品酸水解。
这时可以取一份样品（5%～10% 的消化物，至少 200 cpm）进行磷酸氨基酸分析。进行冻干和后续操作。

3. 步骤 22 中，非常重要的一点是最终的样品溶液中不能有颗粒物质存在，为了确保这一点可以重复几次这一步的离心操作。

4. 步骤 26，标记染料呈绿色，但在电泳时能分离出蓝色（二甲苯蓝 FF）和黄色（edinitrophenyllysine）的成分（图 17.9.2D）。

5. 在步骤 27.5，作者利用起始点周围带孔的吸水纸来使电泳缓冲液浸湿 TLC 平板以尽量使样品集中（图 17.9.1 和图 17.9.2）。吸水纸是由两层 Whatman 3 MM 滤纸沿着边缘缝合在一起做成的。用锋利的软木塞打孔器在围绕起始点的位置（图17.9.1）打出 1.5 cm 的孔。最好每种 缓冲液分别用各自的吸水纸。

6. 缓冲液必须以相近的速度，从周围移向起始点。如果缓冲液需较长时间才浸润到点样点，或不均衡地经过点样点，那样品点不可避免地会形成条纹状。

7. 步骤 30 中，如果还需要将肽从平板中提取出来以备进一步分析之用的话，不要使用烘箱进行干燥。

试剂：

荧光墨水或染料（可以从大部分工艺美术商店购得）

50 mmol/L 碳酸氢铵，pH 7.3~7.6 （新鲜配制的缓冲液 pH 大致为 7.5），和 pH 8.0 （放过夜后 pH 会变为约 8.０，这对步骤 18 中的胰蛋白酶消化或胰凝乳蛋白酶消化比较理想）

2-巯基乙醇

20%（m/V）SDS

50 mmol/L 碳酸氢铵，pH 7.3~7.6，含 0.1% （m/V） SDS 和 1.0%（V/V）2-巯基乙醇

2 mg/ml 载体蛋白（RNase A，BSA 或免疫球蛋白）溶于去离子水中（分成等份储存于 -20℃ 或 -70℃）

100% （m/V） 三氯乙酸（TCA）

96% 冰冷乙醇

30% （m/V） 过氧化氢

98% （m/V） 甲酸

1 mg/ml TPCK-处理的胰蛋白酶（如 Worthington） 溶于去离子水或 0.1 mmol/L HCl （分成等份储存于 -70℃ 或液氮中）

电泳缓冲液：pH 1.9、35、4.72、6.5 和 8.9

绿色标记染料

层析缓冲液

仪器：

单边剃刀刀片或手术刀片

适用于契仑科夫计数法（Cerenkov counting）的闪烁计数器

1.7 ml 带螺旋盖的微量离心管（Sarstedt）

一次性的组织研磨件（Kontes）

摇床

具有吊桶式转子的台式离心机

20 cm × 20 cm ×100 μm 纤维素薄层色谱板（EM Sciences）

小体积可调移液器，由韧性塑料制成的一次性长吸头，如凝胶上样吸头

带滤器的空气管，能滤掉气溶胶和颗粒物质

HTLE 7000 电泳装置（CBS Scientific）

聚乙烯膜 （35 cm × 25 cm； CBS Scientific）

电泳芯子（20 cm × 28 cm Whatman 3MM 滤纸，对折成双层厚度的 20 cm × 14 cm的纸片）

层析缸（CBS Scientific）

风扇，用于吹干 TLC 平板

65℃ 烘箱