蛋白质胰蛋白酶磷酸肽图谱制定实验
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简介
细胞内许多蛋白质被磷酸化修饰。蛋白质磷酸化能影响催化活性、蛋白质在细胞中的定位、蛋白质的稳定性、蛋白质二聚化或蛋白质与其他分子形成稳定复合物的能力。
有几种技术能鉴定蛋白质是否被磷酸化。为了确切地弄清楚一个特定的蛋白质为什么会被磷酸化，有必要精确地鉴定出是哪个氨基酸残基被磷酸化的。这些氨基酸残基可以被点突变，然后检测突变蛋白质的活性变化、细胞内定位，以及与细胞内其他蛋白质的联系。
内容来源于：《精编分子生物学实验指南（第五版）》
来源：丁香实验
操作方法
实验试剂仪器的具体要求和准备见「其他」。1. 用 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离含有 32P 标记的蛋白质样品。2. 电泳后，干胶，四周边缘用荧光墨水标记，对 X 射线胶片曝光（放射自显影）。3. 通过与胶片上的凝胶四周荧光标记的位置的比对确定蛋白质的位置。将胶片与干胶钉在一起，胶片朝下放入一个光盒里。在胶的背面用软铅笔或圆珠笔（不要用标签笔）标记出 32P 标记蛋白质条带的位
备择方案 固相蛋白消化1. 用 SDS-PAGE 凝胶电泳分离 32P 标记的样品，用标准的湿式或半干式蛋白质转移方法将蛋白质转移到 PVDF 或硝酸纤维素膜上。2. 将膜晾干并用保鲜膜或聚酯薄膜包裹以防止膜与胶片粘连，用荧光墨水做标记（见基本方案步骤 2）, 对 X 射线胶片曝光（放射自显影）。3. 比对胶片和膜上的荧光标记的位置以确定蛋白质在膜上的位置（见基本方案步骤 3）。4. 用单边的剃刀刀片割下含有所要的蛋白
辅助方案 从纤维平板上实验材料、试剂、仪器耗材详见「其他」。1. 用锋利的刀片小心地切去蓝色吸头领圈的部分，细的吸口端也裁去约 3 mm。2. 用玻璃棒将一烧结的聚乙烯片从蓝色吸头的广口端塞入，直到与吸头内部紧密接合。 用直径与聚乙烯片相同的玻璃棒有助于保持圆片的平直，即与吸头的纵轴垂直。不要将圆片塞得 过深，因为这会导致吸头胀大并破损。烧结圆片可以在吸头截面上形成一个屏障以截留从平板上 刮下的纤维素。因此，圆片必须牢
