N 端封闭蛋白质内部序列测定实验

蛋白质样品（约 200 mol）
1％乙酸溶液（含丽春红 S 染料） 1％ 乙酸 0.2 mol／L NaOH 0.1 mol／L 乙酸溶液(含PVP-40) 消化缓冲液 1 mg／ml 胰蛋白酶 层析溶液 A 层析溶液 B
0.22 μm 硝酸纤维素膜 酸洗过的玻璃／Petri 培养皿 细头镊子 超声波发生器 离心过滤装置 反相 HPLC 柱子 紫外监测仪 图形记录仪 层析柱炉（选用） 自动蛋白质测序仪

实验试剂及仪器具体要求见其他。

1. 如免疫印迹和免疫检测实验所述，电泳分离目标蛋白并转移到硝酸纤维素膜。最好使尽可能多的蛋白质结合到硝酸纤维素膜尽可能最小的区域，这点很重要。

2. 将硝酸纤维素膜放入盛有含 0.1％ 丽春红 S 染料的 1％ 乙酸水溶液（如 50 ml 用于 8 cm × 10 cm 微型胶）的经酸洗的 Petri 玻璃培养皿。轻轻摇动 1 min。

3. 将膜移入 1％ 乙酸 1 min, 如有需要，换液至条带显迹清晰。

4. 戴无粉尘手套用刀片将目标蛋白条带切下，放入微量离心管中，取一片空白膜作对照。本步骤得到的条带也可放入含 0.5 ml 水的微量离心管中，于 -20℃ 保存。

5. 将膜放入 1 ml 0.2 mmol/L NaOH 中，振荡 1 min 脱色，吸去 NaOH。立即加入 1 ml 含 0.5％ PVP-40 的 0.1 mol/L 乙酸中，室温下轻轻摇动管子 30 min。

6. 用 1 ml 水洗膜 5 次。小心除去所有液滴（如管帽下的液滴）。

7. 用清洁的细头镊子将膜片转移到干净的玻璃表面（如经酸洗的玻璃平板或 Petri 培养皿），切成 1~2 mm 的小片，用镊子收集膜片，挤去过量的液体。

8. 立即将膜的碎片移入盛有 25 ml 消化缓冲液的 0.5 ml 微量离心管中，加入 1 ml 1 mg/ml 的胰蛋白酶，混匀使膜均匀地泡于溶液中，室温放置过夜。

9. 室温高速微量离心 1 s, 回收粘在管壁和盖子上的液滴。室温超声处理样品 5 min。

10. 室温用最大速度微量离心 1 min, 将上清移入离心过滤装置，用 100 μl 消化缓冲液洗膜碎片，合并于上清，在最大速度微量离心样品 20~30 s。如果不进一步分级分离，可冻结保存样品。

11. 用 95％ 层析 A 液/ 5％ B 液，以 0.15 ml/min 的流速平衡 2.1 mm × 250 mm 的反相HPLC 柱，如有层析炉，可在 60℃ 进行分离以优化分辨效果。

12. 注射样品，用 95％ A 液/ 5％ B 液洗柱子 10~15 min。用如下的梯度洗脱多肽：5％~40％ B 液 1 h 以上，40％~75％ B 液 30 min 以上，75％~100％ B 液 15 min以上。在 215 nm 监测多肽的洗脱。

13. 用图形记录仪根据全量程的波形调整至 0.05~0.1 AUFS 监测多肽洗脱峰的出现。尽可能缩小柱子到收集器之间毛细管的长度和容积，聚乙烯酮（PEEK） 管子（内径 0.005 in）有助于达到此目的。

14. 当图形记录仪开始摆动说明有洗脱峰出现时，对一干净的表面（如 Kimwipe 或前面的收集管）擦毛细管的尖，用微量离心管收集这部分组分，马上盖上盖子置于干冰。

15. 比较样品和空白硝酸纤维素膜的色谱图，鉴定源于目的蛋白的多肽相应的峰。加样于按 Applied Biosystems 所述方法经 Polybrene 预处理的玻璃纤维滤膜支持体中，进行测序。

1. 精心细致的操作是不至于往样品中偶然性引入污染蛋白质的关键。洁净的工作环境、细心清洁的玻璃用具和仪器以及戴无粉尘手套是最起码的预防措施。

2. TFA 的浓度应调整至相等于洗脱剂的紫外吸收（215 nm）。除 TFA 外，磷酸、盐酸也可适用。 避免使用含氨或紫外污染物的缓冲液。

3. 胰蛋白酶在 60% B 液时被洗脱，并可用作内标。从特征上看，它的洗脱峰型比大多数多肽要宽。

4. 步骤 9 中尽可能缩小柱子到收集器之间毛细管的长度和容积，聚乙烯酮（PEEK）管子（内径 0.005 in）有助于达到此目的。

5. 步骤 14 须戴干净的手套，如果一直储存于原始的容器并操作时都戴手套的话，商品化的微量离心管已足够干净。

6. 快速冻结能防止分离肽对离心管壁的吸收。样品可以永久保存于 -80°C。

试剂：

含 0.1％ （m/V) 丽春红 S 染料（Sigma) 的 1％（V/V) 乙酸溶液

1％（V/V) 乙酸

0.2 mol/L NaOH

含 0.5％ （m/V) 聚乙烯吡咯烷酮（PVP-40；Sigma) 的 0.1 mol/L 乙酸溶液

消化缓冲液

1 mg/ml 测序级的胰蛋白酶（Promega）

层析溶液 A : 含 5％（V / V) 乙腈的 0.1％ 三氟乙酸溶液

层析溶液 B : 含 70％（V / V) 乙腈的 0.085％ 三氟乙酸溶液

0.22 μm 硝酸纤维素膜（如 Schleicher&Schuell）

仪器：

酸洗过的玻璃或 Petri 培养皿

细头镊子

超声波发生器（如 Bransonic 12）

离心过滤装置，0.22 μm 滤膜，低蛋白质结合

反相 HPLC 柱子（如 Vydac）、紫外监测仪、图形记录仪

层析柱炉（选用）

自动蛋白质测序仪（Applied Biosystems）