分离的细胞核的染色质的微球菌核酸酶消化实验

1. 处死动物或获得活体解剖后，将分离的组织放在置于冰上的 100 ml 烧杯中，马上用 25 ml 核缓冲液 A 冲洗。

2. 将组织转移到 100 mm 塑料培养皿中，置冰上，按以下量加入核缓冲液 A： 肝，8 ml；肾，5 ml； 脾，4 ml。将组织用剃刀刀片或解剖刀切割成大小为几毫米的小块。

3. 将每个小块移入不同的匀浆器。对于上述大小的组织，如果是肝或肾组织，用 15 ml 的匀浆器；如果是脾组织，用 10 ml 匀浆器。处理脾组织时，在冰上放置 10 min 之后再转移，以使血红细胞留在上清中。处理肝或肾组织时，可以马上丢弃上清。

4. 在所有的样本中加入 5 ml 新鲜的核缓冲液 A。混合，再次移去上清，然后再加入 5 ml 新鲜的核缓冲液 A 重悬组织块。

重要提示：从这一步开始，在冷室中进行所有操作。

5. 使用电动组织磨碎机匀浆组织 5～10 次，再手动匀浆 5 次。取少量匀桨混合物加入到 CMF PBS 中，在相差显微镜下观察。观察到的核是灰色的、很圆的小泡。如果仍然有完整的组织或细胞，再进行大约 5 次匀浆，再次观察细胞破碎的量。

6. 将轻薄棉布折叠成 8 层，在核缓冲液 A 中事先浸湿，过滤匀浆混合液到置于冰上的 30 ml Corex 管中。戴好手套，拧绞棉布使液体流尽。

7. 在 15 ml Corex 管中加入 1：1 核缓冲液 A/核缓冲液 B 作为缓冲层。用以下量的缓冲液 A＋B 混合液：肝，1.4 ml；背，1ml；脾，0.6 ml。将勻浆混合液加在缓冲层上。

8. 使用定角转子，40℃， 12 000 g （如 55-34 号转子 10 000 r/min） 离心 15 min。

9. 去上清，沉淀使用如下体积的核缓冲液 B 重悬：肝和肾，11ml； 脾，3.6 ml。先加入 2 ml 核缓冲液 B 轻柔地重悬沉淀成为黏稠的液体，再加入剩余的核缓冲液 B。

10. 在 1/2 in× 2 in的超净 SW50.1 离心管中加入 1.2 ml 核缓冲液 B 作为缓冲层，将重悬液各取 3.6 ml 加在其上（肝和肾分为 3 管，脾为 1 管）。

11. 4℃， 120 000 g （如 SW50.1 转子 37 000 r/min） 离心 90 min。

12. 倒掉上清，将离心管倒置在吸水纸上以去净余液。轻柔地将沉淀重悬于如下体积的核缓冲液 C 中：肝和肾，0.2 ml； 脾：0.25 ml。将同一组织来源的重悬液合并到一个管中，置冰上。

13. 取 5 ul 每种核重悬液加入到 2 ml 的 1 mol/L NaOH 中，用分光光度计测定 OD₂₆₀。 用核缓冲液 C 稀释核重悬液至测得的 OD₂₆₀ 值为：肝 0.25； 肾和脾 0.085。

14. 每种核重悬液各取 1/5 与等体积的 2×TNESK 溶液混合。充分混合后，37℃ 温育过夜。

15. 将剩余的液体在冰上分到以下数目的反应管中：肝和肾，大于 6 个；脾，大约 3个。要经常摇动样品以防止结块。

16. 在第一个管中加入 0.1 mol/L CaCl₂ 至终浓度为 3 mmol/L， 37℃ 温育 3 min， 然后加入等体积的 2×TNESK 溶液，37℃ 温育过夜。

17. 在第二个管中加入 0.1 mol/L CaCl₂ 至终浓度为 3 mmol/L， 37℃ 温育1.5 min 加热核。

18. 在各管中分别加入所需量的 MNase。MNase 的部分消化，可以按如下的量进行尝试：肝和肾，0.1 U MNase/ml 反应液，0.2 U/ml、0.5 U/ml、1 U/ml、2 U/ml； 脾，0.5 U/ml 和 1 U/ml。MNase 的完全消化，尝试 10～100 U/ml。混匀，37℃ 温育 1.5 min。

19. 加入等体积的 2×TNESK 溶液终止反应，剧烈摇动管子几次混匀，37℃ 温育过夜。

20. 对每一个所使用的 MNase 浓度，重复步骤 17～19。

21. 纯化和鉴定 DNA。

所有溶液、反应管、吸量管、吸头都必须为冰冷的。