人胚胎癌（EC）干细胞系的来源和培养实验

相关实验：人胚胎癌（EC）干细胞系的来源和培养实验

最新修订时间：2024-05-13

材料与仪器

步骤

一、试剂的准备

生长培养基

□ P B S A

□胰蛋白酶/EDTA (见 6. 2. 9 节）

□ 25 cm2 的塑料培养瓶

□ 9c m 的培养皿

□ 30 ml 或 50 ml 离心管

□剃须刀片

步骤

(a) 与外科团队合作（见第 2 章），准备装有收集培养基的无菌容器，以便立即贮存及转移切下的组织。确保样品管上清楚地记录了描述的信息，内容包括名称、手术日期时间及必需的相关细节。

(b) 立即将样本转移到组织培养室。如果保存在收集培养基并置于 4℃ 环境中，组织可存活1〜 2 天，但要避免长时间的保存。

(d) 去除非肿瘤的组织（如脂肪）及明显的坏死部分，加人少量的p B S A ，确保样本湿润。

(e) 用无菌剃须刀片将样本细切成l m m 的小块。

(f) 加人 IOmI PBSA，用移液管将切碎的组织转移到离心管中。

(g) 用 PBSA 将组织洗2〜3 次，每次清洗时让样品自然沉降，不需离心。

(h) 将组织块转移到25 cm2 的培养瓶（每瓶大约2 5 块）。

(i)倾斜培养瓶，用移液管从瓶子的角落吸去PBSA，加入 Im I含有抗生素的生长培养基。

(j) 倾斜培养瓶，使组织块均匀分布于生长表面。

(k) 将培养瓶于37°C 中培养 24 h，在此过程中不要移动培养瓶。待组织块已经贴附到培养瓶上，在随后的几天小心地添加生长培养基至l0ml。

(l) 每周换一到两次培养基以促进细胞从组织块向外生长。在这段时间里可明显的看到细胞从组织块向外迁移并增殖。

(m ) 继续培养，经常更换培养基，直到组织块周围铺满单层细胞。

(n) 用 Iml 胰蛋白酶/E D T A 溶液分离培养物， 37°C ， 5 min。

(o)用手掌轻拍培养瓶的侧面，通过快速的侧向运动使细胞离开培养瓶。

(P) 加人 9 ml 生长培养基冲洗整个培养瓶。用移液管收集细胞并轻轻地上下吹打几次，使所有的细胞团散开。

(q) 450#离心细胞，用 IOml 生长培养基清洗。

(r) 用 IOml生长培养基重悬最后得到的细胞团，并将其平分到两个 25 cm2 的培养瓶中。

(s) 37 C 继续培养，每 2〜3 天换一次培养基。

(t) 重复上述酶消化传代步骤以获得足够数量的细胞用于低温贮存移植系和细胞样品（见 6. 5 节）。

方案 6. 2 克隆化的 E C 细胞系的建立

无菌或无菌准备

□ 照射的 S T O 小鼠伺养细胞 [Martin and E v a n s ， 1975]，照射时约 7 0 % 细胞汇合（又见方案 11. 2)

□ P B S A

□ P B S A /5F B : 含有 5 % 胎牛血清的 P B S A

□胰蛋白酶 / E D T A ( 见 6. 2. 9 节）

□阶段特异性胚胎抗原-3 (S S E A -3)，多能干细胞表面的一种抗原标志分子（见图6.1 ) 。

□ Polysdence BioMag微粒，抗小鼠 IgM (用于识别SSEA- 3 的 IgM 独特型）

□ 15m l 的聚丙烯离心管

□ 多孔板， 6 孔和 1 2 孔

□ 培养皿， 3. 5c m 和 9c m

□玻璃巴斯德移液管，在火焰上拉成细小的尖头

非无菌

□血细胞计数板

□ 0.4W/V的台盼蓝或0.15W/V的赤藓红 B (又名地衣红B )

□倒置显微镜，用 7 0 % 的酒精擦净，置于方便使用显微镜的垂直层流罩内。要注意由于使用了显微镜， II级生物安全橱的安全状况可能会打折扣，在使用前应该检查一下。

步骤

(a) 使用移植细胞中最早可传代的生长汇合的细胞（见上）。

(b ) 吸出生长培养基，用 5m l P B S A 清洗。

(d) 37°C 孵育细胞，直到细胞变圆并开始脱落（5m i n )。用手掌轻拍培养瓶的侧面，通过快速的侧向运动使逗留的细胞离开培养瓶。

(e) 加人 9m l 生长培养基冲洗整个培养瓶以获得尽可能多的细胞。用移液管轻轻上下吹打几次使所有细胞团散开，得到单细胞悬液。

(f) 用血细胞计数板计数细胞。一般来讲，细胞存活率要大于9 5 % , 这可以通过一些简单的染料排斥分析法来检测（例如，用〇.4 % W /V 的台盼蓝或0.1 5 % W /V 的赤薛红 B 染色 [F r e s h n e y， 2005])。

(g ) 用 5m l P B S A /5F B 将细胞稀释到 l X I O V m l 。

(h ) 将细胞悬液与1 : 5 稀释的 S S E A -3在 15m l 的聚丙烯离心管中， 4°C 条件下共罗浮育45m i n 。

(i) 离心细胞（450 g , 3m i n )，在 4°C 条件下，用 P B S A /5F B 洗 3 次。

(j) 通过直接的阳性磁粒分选分离与 S S E A -3发生免疫反应的细胞，磁粒上带有B i o M a g 的抗小鼠I g M 抗体。按照制造商提供的操作步骤进行，简述如下：

i) 将磁粒与细胞在 4°C 条件下孵育30m i n 。

ii) 轻轻混合离心管中的物质，靠管壁放一块磁铁停留30s 使细胞与磁粒结合而聚集。

iii) 磁铁仍在原位，小心倾去上清，使细胞留在管壁上。

iv) 拿开磁铁，将细胞重悬于P B S A /5F B 中。

V) 重复分离过程，增加 S S E A -3阳性的细胞的纯度。

(k ) 用 5m l P B S A /5F B 将分离的细胞重悬，血细胞计数板计数。大约 1000个细胞接种到 9c m 的培养皿中，加 IOml P B S A /5F B 。

(l) 将带有相差镜头的倒置显微镜放到无菌的环境中（例如用合适的层流罩；用乙醇擦净显微镜的载物台以保证无菌）。用火焰拉制的细小玻璃吸管挑出单个细胞放人滴在 3. 5c m 培养皿中的 IOOul月牙形 P B S A /5F B 中。用显微镜的 4 0 倍物镜检查挑出的是否是单个细胞。

(m) 把每一个细胞转移到 1 2 孔板的不同孔中，孔中有经照射的 S T O 伺养细胞及生长培养基。

(n) 维持共培养 1 0 天，每 2〜3 天换一次培养基。

(o)每孔加0.3m l 胰蛋白酶/E D T A 以移动共培养的细胞。将全部细胞悬液接种到有新鲜饲养细胞的6 孔板中，加 3m l 培养基。按步骤（n ) 的方法共培养。随着干细胞群体的增加可在饲养层细胞中明显地看到E C 细胞（图 6, 2)。

E C 细胞的常规传代及收获

第一种（见方案 6.3) 是机械法，这种方法简单快捷，可以避免整个
: 胞 n养觸分离。^ 難重要的，因为軸魏和高度汇合 _ 持可赚止其在培养过程中自发分化。第二种是用酶处理将培养義胞消化鮮雜悬液。这在用细胞计数板计数细胞或为流式实验准备细胞时是必需的。第二种方法（方案 6 4 ) 有时可用于细
胞传代』但不 ; 传代推雜麵方法，目为它可細咖轉改变細雜质。两种方案所用的来自75c m 2 的组织培养瓶中生长汇合的细胞都是已经处理过的。

方案6. 3 机械分离法继代培养E C 细胞

试剂和材料

无菌

□ 生长培养基（见 6. 2.1 节）

□ PBSA

□ 酸洗的玻璃珠（见 6. 2.4 节)

□ 75c m 2 的塑料培养瓶

步骤

(a)从培养的细胞中吸出培养基，用 5 m i P B S A 清洗。

(b ) 加入约 1 5 个酸洗的3m m 的玻璃珠和5m l 生长培养基。

(d) 用 I O m l 的移液管收集悬起的细胞，将移液管的尖端靠在瓶子的底部角落，上下轻轻吹打几次，吹散较大的细胞团。

(e) 用同一个吸管收集细胞悬液并转移到一个新的75c m 2的培养瓶中，加 50m l 生长培养基。

(f) 确保细胞悬液充分混匀后等分到三个新的 75c m 2的培养瓶中（每瓶 20m l ),1 : 3分离。

实，细胞表面抗原阶段特异性胚胎抗原-3 (SSEA- 3 ) 和— 4 (SSEA- 4 ) 及 TRA-1-60是人 E C 干细胞的特征性标志[Andrews etal.， 1996]。通常，汇合后高密度的人E C 干细胞在最佳生长条件下高水平表达这些分子标志。但是，非最佳培养条件及细胞分化会导致 SSEA- 3 的表达量减少，而细胞分化特定通路的相关蛋白表达上调[Andrew,〗982;
Przyborski et al.， 2000]。方案 6. 5 提供了一种常用的流式细胞术分析人E C 干细胞的方法。

方案 6. 5 流式细胞术检测 E C 细胞表面标志

试剂和材料

无菌或无菌准备

□ 汇合生长的 E C 细胞

□ P B S A

□胰蛋白酶 / E D T A (见 6. 2. 9 节）

□ 冲洗缓冲液（W B ; 见 6. 2. 10节）

□ 一抗：例如， S S E A -3 上清（ Developmental Studies H y b r i d o m a B a n k ), W B 1 : 5稀释

□ 一抗，突光标记， W B 稀释：例如，大鼠抗小鼠 I g M 用 W B 1 : 2 0 稀释，用于检测小鼠单克隆抗体S S E A -3

□ 9 6 孔微量滴定板，圆底，带盖

非无菌

□ 活细胞染料： 0.4% w /y 的台盼蓝或0. 1 5 % W /V 的赤藓红B

□血细胞计数板

□微量滴定板离心机或用于正规离心机的微量滴定板支架

□流式细胞仪

步骤

(a) 选用一瓶生长汇合的人E C 干细胞（见图 6.3 ) ，从培养的细胞中吸出培养基，用 5m l P B S A 清洗。

(b ) 加人 I m l 胰蛋白酶/E D T A 并倾斜培养瓶，保证单层细胞被覆盖。

(d) 加入 9m l 生长培养基冲洗整个培养瓶以获得尽可能多的细胞。用移液管轻轻上下吹打几次使所有细胞团散开，得到单细胞悬液。

(e) 用血细胞计数板计数活细胞。一般来讲，细胞存活率要大于，这可以通过一些简单的染料排斥法来检测（例如，用 0 . 4 % W / V 的台盼蓝或0.15 % W /V 的赤藓红 B 染色）。

(f) 离心细胞（450 g , 3m i n ) ，用 W B 重悬细胞，调整其浓度为1x1 0 ⁷ml

(g) 将适量的抗体溶液（每孔 50ul) 加人圆底的 9 6 孔板中（避免使用相邻的孔以防止液体溢出后互相污染），例如， SSEA-3 上清用 W B l : 5 稀释。纯化的单克隆抗体通常稀释倍数较高，如用 WB 1 : 1 0 0 稀释。（NB: 可以通过预先滴定来选择合适的稀释比例，以获得较高的结合率）。

(h) 在含有抗体的孔中加入细胞悬液，每孔 50ul(约 5X10⁵/ 孔）。

(i) 盖上盖子， 4°C 条件下置于定轨摇床中轻摇 30min。

(j ) 将细胞在460 g的转速下离心 3 min。在移去上清之前反转细胞板检查细胞团。

(k) 加人 100ulWB, 离心细胞，弃上清，重复两次。最后一次不加 WB。

(l) 加入 50^1 荧光标记的二抗，例如 1 : 2 0 稀释的大鼠抗小鼠 IgM , 用于检测SSE A-3。

(m) 盖上盖子，置于轨道摇床中于 4℃、避光条件下轻摇 30 min。

(n) 按照上述方法用 W B 清洗以除去二抗。

(o) 将细胞转移到标记好的、含 0.2 ml WB、用于做流式的管中。在过流式细胞仪之前将细胞置于冰上。

(P) 用流式细胞仪检测荧光强度，根据制造商提供的说明书设定适当的滤光器。

注意：必须保证单细胞悬液中没有细胞聚集，以使得通过流式细胞仪的是单个细胞，所以实验前要在显微镜下检查细胞悬液。同时要做阴性对照来设置背景阈值。如果不能立即过流式仪，也可以用多聚甲醛的温和溶液（0. 2 % w / v 溶于 P B S A ) 固定细
胞， 4°C 过夜暂时保存样本。

6.4. 2 发育潜能的评价

6.4.2. 1 体内畸胎瘤的生长

众所周知，将人的胚胎干细胞和恶性的 E C 干细胞植入免疫缺陷的宿主时会形成由多种分化细胞类型组成的复杂的畸胎瘤 [Andrew et aL， 2001; Przyborski 2005;Cooke etal.， 2006]。这一点首先被 Kleinsmith 和 Pierce [1964] 证明，他们指出将小
鼠肿瘤的单个 E C 细胞移植到新的宿主会导致新的畸胎瘤形成，并且与原来的肿瘤结构相似。事实上，这是在建立 E C 干细胞系之前保存 E C 干细胞的一种方法。现在，很多科学家使用细胞移植和畸胎瘤的生长作为评价新产生的胚胎干细胞和 E C 干细胞系的常规方法 [ 见 Przyborski 的综述， 2005]。体外实验可以更多地控制细胞分化的特征，但这种方法是有局限性的。细胞培养目前还不能为三维细胞生长提供适当环境，无法促进
相邻细胞和组织间的相互作用，以及接触不到生长因子及组合的信号分子等，这可能就是为什么植入的干细胞能够极度分化的原因。方案 6. 6 描述了在免疫缺陷小鼠中由人的E C 干细胞产生皮下异种移植肿瘤的简单方法。

方案 6. 6 作为皮下异种移植物的 E C 细胞的生长

试剂和材料

无菌或无菌准备

□ 人 E C 细胞

□ 收集培养基（如果发生的肿瘤需要培养）

□ 生长培养基（如果发生的肿瘤需要培养）

□胰蛋白酶 / E D T A (见 6. 2. 9 节）

□ P B S A

□ H a m i l t o n 注射器及 2 1 号针头

非无菌

□裸鼠

□血细胞计数板

□ 活性染料： 0. 4 % W /V 的台盼蓝或〇. 1 5 % W /V 的赤藓红B

步骤

(a) 用 I m丨胰蛋白酶/E D T A 溶液收获人 E C 干细胞（见图 6.3) , 使之形成单细胞悬液，按照方案6.5 (e) 步骤所描述的用细胞计数板计数活细胞。

(b) 洗细胞，重悬于 P b s a 中，调整细胞浓度为 I x i o V m l 。

(d) 遵照善待动物相关条例将裸鼠养1 2 周，通常在畸胎瘤还是一个小团块、在皮下靠近移植部位可以触摸到时就要进行首次鉴定，鉴定时要记录肿瘤的位置和用测径钳测量肿瘤的大小，并称量动物体重。

(e) 在合适的时候（比如肿瘤直径达到i c m ) 时，处死动物（用批准的、规范的操作）并立即取下肿瘤组织，当心不要连带任何宿主组织。

(f) 采用什么方法分析组织将决定接下来的处理方法。例如，要做冰冻切片就要将组织冻起来，而石蜡包埋和组化分析要先固定组织。有很多固定组织的方法，包括Bou i n』 s 溶液（见 6.2. 11节），该溶液可以很好的保存组织形态，常用于—般的组化( 图 6 . 4 ; 彩版 6)。或者用 4 % 的多聚甲醛，也可以保持组织结构，石蜡包埋及切片后更适合做免疫组化

(g) 另外，肿瘤组织可外植培养。为保持细胞活性，在将组织运输到培养地点时应将其放在 37 C 的收集培养基中。在进行组织培养时，按照前面描述的步骤（见方案6. 1 ) 进行。

6.4.2.2 外源性刺激引起的体外分化

培养的哺乳动物 E C 干细胞被认为是研究体外胚胎发生早期阶段的有用模型。Jones-Villeneuve 等 [ 1 982 ] 和 M c B u r n e y 等 [ 1 988] 的工作首先证明了视黄酸可引起培养的小鼠 E C 干细胞分化，形成神经元和胶质细胞群体。随后， M a c p h e r s o n 和M c B u r n e y [1”5] 报道了在研究神经发育过程中小鼠 P 19 E C 干细胞生长和分化的具体方法。后来这些方法被其他的研究者采用，用于研究人 E C 干细胞的分化 [ A n d r e w setal.,1984； Pera et al., 1989 ； Stewart et al., 2003; T h o m p s o n et al., 1984] 〇 T E R A 2的亚系在该项研究中尤其有用.下面是诱导培养的人 E C 干细胞形成神经衍生物的经典方法，这里介绍了两种方法：方案 6. 7 描述了细胞以单层贴壁的方式生长；而方案 6 . 8 中，细胞在接种到包被表面之前是悬浮生长的。

方案 6.7 呈黏附单层的 E C 干细胞的分化

试剂和材料

无菌

□ 培养的 E C 干细胞（见方案 6. 2)

□ 生长培养基（见 6. 2. 1 节）

□胰蛋白酶 / E D T A ( 见 6. 2. 9 节）

□ 视黄酸（见 6. 2. 5 节）

□ 阿糖胞苷（见 6. 2. 7 节）

□ 氟脱氧尿苷（见 6. 2. 7 节)

□ 尿嘧啶（见 6, 2. 7 节）

□ 75c m 2的培养瓶

步骤

(a) 用 I m I 胰蛋白酶/E D T A 溶液收获 E C 干细胞（见图 6. 3)，使之形成单细胞悬液，按前述方法计数细胞（见方案 6. 4)。

(b) 要诱导细胞分化，按照 2 X l0 Vcm2的密度接种细胞（相当于每个 75 cm2的培养瓶中接种 1.5X 10⁶个细胞，加入含有 10mol/L 视黄酸的生长培养基（每瓶 20m l )
(阶段 1)。细胞会在 24 h 内贴壁，在 3〜4 天后形成松散汇合的单层细胞。细胞密度会继续增加，但一般来讲不会生长过度，因为大部分细胞开始分化，并最终到达有丝分裂期后阶段。神经元群体位于其中，非神经细胞将在 2〜3 周内可以区分（图 6.5)。

(d ) 2 1 天后，按前述方法用胰蛋白酶/E D T A 溶液消化培养的细胞，此时 37°C 条件下的孵育时间要延长到 7〜l O m i n 。

(e) 加人 IOml生长培养基，轻轻上下吹打细胞悬液，打散所有残留的细胞团，形成单细胞悬液。

(f) 将细胞平均分种到 4 个新的培养瓶中 [ 大小与（b) 步骤中使用的相同], 在不含视黄酸的培养基中继续培养 4〜6 天（A2 阶段）。在此过程中，可以辨认出在平铺的非神经细胞背景上生长的神经元（图 6.6)。

(g) 从培养的 A2 阶段的细胞中吸去培养基，加人 Im l胰蛋白酶/E D T A 溶液，室温下放置 2 min。

(h ) 用手掌轻拍水平放置的培养瓶的侧面，短暂急速地拍打 5 次，产生侧向运动使贴附不紧的细胞脱落下来。

(i) 加人 IOml生长培养基，收集酶法/机械法分离下来的细胞。

(j) 将两瓶以上细胞混合，计数细胞，清洗，然后用生长培养基重悬细胞。

(k ) 将细胞按 2 X 10⁵/ c m 2的密度接种（A 3 阶段），加人含有下列物质的培养基(两种任选）：

(i) lumol / L 阿糖胞苷（只在开始 1 〇天添加），3umol/L 氟脱氧尿苷，10umol/ L 尿嘧唆，增加神经细胞的纯度并减少非神经细胞的增殖（图6.7)。

或（ii) O.l u m o l /L 阿糖胞苷（只在开始 1 〇天添加）， 3umol/ L 氟脱氧尿苛，5umol/L 尿嘧啶，限制星形胶质细胞的增殖。

方案 6. 8 呈悬浮细胞团的 E C 干细胞的分化

试剂和材料

无菌或无菌准备

□ 培养的 E C 干细胞（见方案 6. 2)

□胰蛋白酶 / E D T A (见 6. 2. 9 节）

□ 视黄酸（见 6.2. 5 节）

□ 阿糖胞苷（见 6. 2. 7 节）

□ 氟脱氧尿苷（见 6. 2. 7 节）

□ 尿嘧啶（见 6. 2. 7 节）

□ 9c m 塑料培养皿，细菌学培养级别

□ 15m l 离心管

□包被了多聚-L -鸟氨酸和层粘连蛋白的培养板和培养皿（见 & 2. g 节）
步藤

(a) 用 I m l 胰蛋白酶/E D T A 溶液收获 E C 干细胞，使之形成单细胞悬液，按前述方法计数细胞。

(b ) 为了诱导细胞分化，每个 9c m 的培养皿接种 5 X IO⁵ 个细胞，加入 1 0 m 丨生长培养基。

(d ) 将细胞继续培养 2 周，每 3〜4 天更换一次含有视黄酸的培养基。培养第一周，会形成细胞的悬浮聚集体（图 6.9)。用新的培养基重悬细胞之前，必须轻缓地以 20g的速度离心 2m i n 沉淀聚集体。

(e) 将细胞悬液转移到 1 5 m l 的离心管中， 20 g离心 2m i n 轻缓地沉淀细胞聚集体。用不含视黄酸的生长培养基将细胞重悬，接种到包被过多聚-L -鸟氨酸 (10ug/ml) 和层粘连蛋白 (10ug /m l) 的基质上。

(f) 将细胞在含有有丝分裂抑制剂的生长培养基中继续培养2〜3 周 [lu m o l /L 阿糖胞苷（只在开始 1 0 天添加）， l0umol/L 氟脱氧尿苷 ,10umol/L尿嘧啶]。在此期间，聚集的细胞会贴附到培养表面，大部分会发育出外展的神经突（图 6. 1 0 ，彩图 7)。

6.5 低温保存

当细胞系建立起来，具备了 EC干细胞的典型特征，并没有被污染，就可以低温保存了。可以通过这种方式来保存 E C 干细胞，并且复苏的细胞活性良好。

方案 6. 9 E C 干细胞的冻存

试剂和材料

无菌或无菌准备

□ E C 干细胞培养物， 25c m 2 或 75c m 2 (见方案 6. 2)

□ 冻存液（见 6. 2. 3 节）

非无菌

□用于冻存的绝热箱

□ -70°C 冰箱

□液氮罐或替代物

步駿

(a) 按前述方法（见方案 6.4) 收获细胞， 450g离心 3min。

(b) 弃掉上清，用冻存液将细胞重悬（每个 75c m 2 培养瓶加 3m l , 25c m 2 培养瓶加 lml)。

(d ) 在冷冻管上标记好细胞系的名称、传代次数和日期。

(e) 将冷冻管放到绝热盒中再转移到一 70°C 冰箱中使其慢冻。

(f) 第二天早上将样品转移到长期保存的容器中，一 140°C ( 机械冷冻器）或—196°C (液氮）中保存。

(g) 保证记录精确并随时更新。

方案 6. 10 冻存的 E C 干细胞的复苏

试剂和材料

无菌

□ 生长培养基（见 6.2. 1 节)

非无菌

□ 37°C 水浴

步骤

(a) 将细胞从冷冻储存设备中取出，转移到便携式液氮筒。

(b) 将冷冻管放在 37°C 水浴中快速融化。

(d ) 450 g•离心 3m i n ，弃掉上清。

(e) 用 20m l 生长培养基重悬细胞，平分到两个25c m 2 培养瓶中。

(f) 将细胞培养过夜，第二天检查，更换培养基。

(g) 更新记录，显示细胞已从冻存设备中取出。

来源：丁香实验

人胚胎癌（EC）干细胞系的来源和培养实验

一、试 剂 的 准 备

一、试剂的准备