蛋白质亚基的存在及其大小和分子质量的测定实验

一、引言

蛋白质分子大小是许多分离方法的基础，并 且 是 一 种 对 已 知 分 子 或 未 知 杂 质（如20 k D a 产物）的简单方便的描述词。但 是 ，尽管方法学和数据处理方面已经有了显著提高 ，如果要精确估计分子大小仍需谨慎。 本章中，「大小」是指蛋白质的物理维度, 分子质量则表示蛋白质量。本章也会考虑蛋白质的不对称性[或轴比(axial ratio)], 因为分子质
量这一性质通常会影响分子表观大小的测定。

许多蛋白质组装成大的聚合物, 而每个组成链称为一个亚基(subunit;T i masheff andF a s m a n , 1971)。然而，亚基概念的界定因不同研究者的研究背景而异, 需要考虑被研究的系统，以及该系统的工作目标。在本章所讨论的内容中, 独立的蛋白质亚基被定义为不含连续的多肽骨架的蛋白质组分。因此，通过二硫键或非共价相互作用相连接的肽段都被认定为亚基，尽管这些亚基可能都是同一个多肽链的水解产物。

确定蛋白质大小和分子质量的方法可分为3 个广泛的类别: 化学分析法（chemicalanalysis)，如组成分析法或对影响溶剂性质的分子作用（如蒸汽压、冰点和沸点）进行分析; 传输法(transport m e t h o d ) ，基于应对外力作用下(如电场力作用、离心力作用, 机械力作用) 分子的移动; 散射法（scattering m e t h o d ) , 基于人射辐射(如光 、X 射 线 、中子)与分子的相互作用。由于这些方法针对分子的不同特性，因此方法的选择依赖于研究者需要了解研究系统的哪个方面以及所需准确度。表 39. 1 概述了许多方法的能力、优点和局限 。除了这些标准，蛋白质和方法需要相互兼容，要考虑到可用的蛋白质样品量、可到达的纯度水平(Rhodes and L a u e , 2009)、溶剂需求，以及其他可能干扰具体方法的任何蛋白质特性。这些方法对于其他的分子性质检测也很有效，这会在下面单个技术的讨论中涉及。许多技术都可以彼此联用(如黏度与沉降系数法、组 成 和 S D S 凝胶电泳法、高效液相色谱及质谱)。这里并没有列出所有方法，还有一些方法(如 辐 射 失 活 和 c D N A 分析)可能仅适用于一些特殊情况。

二、化学方法

2.1 组成

2.1.1 概述

尽管组成检测目前仅用于一些特别的情况，但 是 这 些 方 法 能 够 提 供 氨 基 酸 或 特 定 辅基 团 物 质 的 量 ，因 而 可 以 用 公 式 M_min= m/n 估 计 一 些 蛋 白 质 的 最 小 分 子 质 量 ，其 中 M_min为蛋白质的分子质量估计值(g/mol，m 为 分 析 中 所 用 的 蛋 白 质 量 ，n为分析中测量所得的 蛋 白 质 相 关 组 分 的 摩 尔 数 。针 对 特 定 辅 基 团 进 行 氨 基 酸 分 析 、末 端 分 析 、定 量 分 析(NobleandBailey, 2009), 可以获得非常好的定量值。这种基于组分的分子质量分析法所需的材料量依赖于所使用方法的灵敏度。由 于 许 多 新 型 分 析 技 术 在nmol〜Pmol级都
非 常 灵 敏 ，因此可能仅需要微克甚至更少的样品就能满足分析要求。

质量估计误差和特定成分的分析误差均决定了最小分子质量估计的误差。因 此 ，最小分子质量估计误差将会由上述两个参数的测量方法决定。将不同组分的分析数据结合可提高准确度。因 此 ，建议采取基于氨基酸分析、末端基团定量分析或非蛋白质因子定量的独立估计方法。

由于组分分析法只能提供一个最小分子质量，因此可将这些数据与其他方法得到的结果结合得到蛋白质的质量。 # 个精确的组分分析可以与其他低准确度的全分子质量检测 方 法 联 用 来 产 生 高 准 确 度 结 果 。也 许 ，这 种 手 段 最 常 用 的 例 子 就 是 氨 基 酸 分 析[BUrgeSs(2009) 的 文 献 中 介 绍 了 目 前 较 常 用 的 基 于 序 列 的 方 法 ，更 多 见 B artolom eo和Maisano (2006) 的 文 献 ]和 S D S 凝 胶 电 泳 法 的 结 合 。理 论 上 ，应 通 过 测 定 能 代 表 整 个 氨基酸组成的最小整体来估计M 值 。实 际 上 ，所 有 2 0 个 不 同 氨 基 酸 浓 度 的 不 确 定 性 使 得这个方法本身就不十分可靠。然 而 ，S D S 凝胶电泳获得的近似 分 子 质 量 可 以 帮 助 指 导 从
相 对浓度中选择近似绝对浓度，提 示 研 究 者 对 于 一 个 数 值 是 该 向 上 舍 人 (round up)或者向下舍入(round down) 。

2.1.2 方法
蛋白质量最准确的测量方法应该是测量蛋白质在挥发性缓冲液(如碳酸氢铵)中的干重 。在非挥发性缓冲液中可根据含蛋白质溶液样品和仅缓冲液的样品干重的质量差距来计 算 蛋 白 质 量 ，但是这样做准确度低并且不 适 合 部 分 挥 发 性 的 缓 冲 液 。蛋白质浓度检测常常用来代替干重测量(质量的值为质量浓度和体积的乘积）。浓 度 检 测 可 以 用 折 光 法 、分光光度法或化学法测量。这些方法的精度是可接受的，但准确度常常有限, 主要问题是难 以 标 准 化 (Nozaki，1986)。尤 其 对 于 糖 蛋 白 、脂 蛋 白 或 其 他 组 成 较 为 特 殊 的 蛋 白 质 ，分析方法也许仅对一些蛋白质特定组分(如肽键)敏感。这些列出的检测方法中，折光仪[或示差折光检测器(differential refractometry)]对 浓 度 测量是准确度最高的，氨基酸分析也是一种合适的定量方法。

2.1.3 问题和局限

基于组成的最小分子质量分析对样品纯度较为敏感。任何影响质量估计或定量分析的杂质都会影响测量的准确度。由 于 这 些 分 析 都 不 能 对 初 始 物 质 进 行 分 离 ，杂质或异质成分将会影响最终结果。因此分析之前样品必须进行纯化。样品纯度的要求取决于杂质的 性 质 、质量估计或分析方法对杂质的敏感性。所有这些方法, 都必须假定每摩尔的蛋白质中仅含一个摩尔或者^ 个整数 摩 尔 值 的 分 析 组 分 。 由 于 没 有 可 用 的 四 级 结 构 的 信 息 ，仅可得到一个最小分子质量。例 如 ，对 血 红 蛋 白 或 肌 红 蛋白中血红素铁的定量分析将会产生近乎相同的表观分子质量，尽管事实上完整的血红蛋白分子质量是肌红蛋白的4 倍 。

2.2 依 数 性

2.2.1 概述

溶质溶解到溶液中减少了溶剂的化学势，并且导致了一些可见的现象，这种共同的现象称为依数性(colligative property)(Tinoco et al.，2002)。基于这个现象它们的关系为

一种溶质的分子质量。这样任何一种溶质(包括蛋白质)的分子质量，都可以通过测量冰点的下降、沸点的升高、渗透压或蒸汽压来确定。由于像蛋白质大小的分子造成的冰点或沸点的改变通常很小，并且在这些极端温度时蛋白质分子一般不稳定，因此不适用于研究蛋白质溶液。另外，蒸汽压和渗透压可被用来测量蛋白质分子质量，但是这里不详细讨论。蒸汽压、冰点和膜渗压计都有商品化的产品，蒸汽压和膜渗透压计在临床和制药业中最为常用的。蒸汽压和冰点渗压计可以可靠地在水中测量25 000左右的分子质量，而膜渗压计可用来测量分子质量大于20 0 0 0 的蛋白质。通常要求蛋白质溶液的浓度为0.1〜1 mg/m L，样品体积为10〜200 uL 。与测量组成的方法一样，这些方法对样品质量的准确度要求都比较高。应该注意到，任何依数性测量获得的分子质量都是一个平均值，并且易于受到低分子质量杂质的影响。其他信息 可 参 见 T in o c o等（2002)的文献和产品说明书。

三、传 输 方 法

3.1 沉降平衡法

3.1.1 概述

沉 降 平 衡 法 是 一 种 测 量 蛋 白 质 天 然 分 子 质 量 的 准 确 和 有 效 的 方 法（Cole et al. ，2008)。这种方法简单, 无破坏性并且相对快速。所有描述沉降平衡的参数都易于测量或估计 。该方法有几个独特的能力，可以量化广泛的化学系统的分子质量、化学计量和结合
常数。例如，通过在中性的有浮力(非沉降)的去污剂中进行沉降，可以测量能够溶于该去污剂的蛋白质的分子质量(F ish，1978)。还有许多其他方法无法分析的系统都能用沉降平衡法成功评价。然而 ，由于沉降平衡法通常需要精密而且昂贵的仪器，而且其他方法已经可以达到许多目的并获得足够的数据, 因此随着强大的沉降速率分析法的成熟，沉降平衡法的使用率已大大不如过去。虽然如此，沉降平衡法仍是目前定量研究蛋白质-蛋白质结合的最有效的检测方法之一, 在研究具有弱或中等结合常数的蛋白质系统上起到了无法替代的作用。

3.1.2 方法

沉降平衡实验的目的是沿着离心池的径向轴产生一个可测的蛋白质浓度梯度。完成沉降平衡的时间取决于溶液柱（solution column) 的长度、减 少 后 的 分 子 质 量（reducedmolecular weight)值(ex)及扩散常数。由于达到平衡的时间取决于柱长的平方，许多离心池和技术采用短柱(0.75 m m 或 3 m m 长）（Ralston, 1993)。 利用这些离心池, 不同的蛋白质可在几分钟到数小时内达到平衡。在给定的转速下，采 用 30〜 60 m in 间隔来测量浓度分布，如若浓度分布不随时间改变，则 说 明 已 经 达 到 了 平 衡 。 一 些 软 件（如 HeteroAnalysis)可帮助自动化完成该过程(Cole et a L ， 2008)。

一个典型的沉降平衡离心实验需要3〜4 个浓度，每 个 浓 度 需 100〜200 ul溶液 ，浓度范围一般从0.1 mg/m L 到 约 3 mg/m L。这些溶液需要用含相同组分的合适的缓冲液配制。沉降平衡离心实验通常在不同转速下进行，低速时离心槽顶部和底部的浓度比3〜5, 高速时离心的弯月面中已完全不含溶质。

即 使 没 有 分 析 型 离 心 机 (analytical centrifuge) ，沉 降 平 衡 时 的 浓 度 分 布 也 可 以 用 多种 方 法 测 得 。如 果 测 量 中 用 到 了 制 备 离 心 机（preparative centrifuge) (Attri and Mi n t o n ,1986)或 「气 动 离 心 机 」(airfuge)(Bock and Halvorson，1E 583 ) ，可 将 离 心 物 质 分 离 后 使 用任 一 与 蛋 白 质 浓 度 相 适 应 的 检 测 方 法 。 由 于 任 何 浓 度 测 量 方 法 都 可 用 到（如 酶 活），因此采 用 制 备 离 心 机 进 行 沉 降 平 衡 的 分 析 时 ，可 用 来 检 测 复 杂 混 合 物 和 高 浓 度 溶 液 中 的 分 子质 量 (Howlett etal. ，2006)。但 是 需 要 通 过 不 同 时 间 长 度 的 离 心 实 验 来 确 保 混 合 物 体 系
达 到 了 平 衡 状 态 。而 且 ，在 转 子 减 速 或 离 心 组 分 分 离 时 ，由 于 浓 度 梯 度 的 破 坏 ，这 些 离 心方 法 的 准 确 度 有 所 缺 失 。然 而 ，有 必 要 在 不 同 时 间 点 通 过 一 些 实 验 来 确 保 混 合 物 体 系 达到 了 平 衡 状 态 ，但 在 转 子 减 速 或 离 心 组 分 分 离 时 ，由 于 浓 度 梯 度 的 破 坏 ，这 些 离 心 方 法 的 准 确 度 有 所 缺 失 。分 析 型 超 速 离 心 机 可 以 缓 解 此 类 问 题 , 因 为 其 可 在 离 心 进 行 中 离 心 组分 保 持 平 衡 时 ，通 过 光 学 方 法 检 验 溶 液 成 分 。

目前有3 种光学系统可用于标准分析型离心机: 紫外线或可见光吸收扫描仪、瑞利干涉仪(rayleigh interferometer)和突光检测器。这 3 种系统能提供互补信息，如某些场合需用荧光和吸收光学的选择性及灵敏性, 而有时则需要瑞利干扰仪系统的精确度和准确度 。荧光系统拥有卓越的灵敏度(低达100 pmol/L 的荧光素），但是需要荧光分子或荧光标记分子(Kroe and Laue， 2009)。荧 光 光 学系统的精度类似于吸收光学系统, 但是准确度有限, 因为荧光基团的量子产率(quantum yield)对分子所在的环境非常敏感。

必须精确计算离心半径，分析超速离心机的光学系统可以提供这些信息（Ralston,1993)。使用制备离心机时，则需通过几何学计算半径。原始文献(original article)介绍了如何计算不同转子和离心棺的半径(Attri and M nton, 1986; Bock and Halvorson，1983)。

3.1.3 问题和局限

沉降平衡分析的核心问题是获得分析用的足量高纯度的蛋白质。即使对于高纯度的蛋白质，在平衡分析前进行沉降速率分析还是有益的(C o le e t al.，2008)。瑞利干涉仪光学系统仅需要20 uL浓 度 I mg/m L 的溶液即可测量分子质量，而且一些荧光溶质的浓度可以更低。尽管这种方法所用的材料量少于通常凝胶电泳, 但是少量杂质的存在可能会增加解释数据的难度，特别当杂质是未知或者未预料到的情况时。如果使用制备离心机，并且测量方法灵敏度较高时，需要的材料量也可以较少, 但是准确度较低。同样需注意的是, 沉降平衡法的分离程度达不到沉降速率、凝胶过滤和凝胶电泳的水平。尽管如此，离心力一定程度上还是分离了溶液，去除了一些大颗粒(如粉尘、絮凝物、聚合物）。这意味着尽管分析型离心需要一些合适的技术，但不需要像散射法那样仔细的纯化样品。需注意缓冲液成分同样在离心力场中得到分离，因此最好选择5 接近溶剂（1 )的缓冲液 。 T r is 等缓冲液适用于沉降实验，而磷酸盐缓冲液则可能在某些情况下会引起问题
(Yphantis， 1964)。 充分的透析和仔细填充离心 稽 可 以 将 缓 冲液 沉 降 的 问 题 降 低 到最小。

有些方法可检测用于沉降平衡法分析的样品中的杂质。其中一种是绘制表观分子质
量 (可 通 过 Inc关 于 r²/ 2 的函数图的局部斜率获得）作为浓度函数的图[M (c)]。如果M (C)图与转子速率无关，那么可以十分确定样品是纯的。 R hodes和 Laue (2009)的文献中简要介绍了更多测量异质性的高灵敏度方法。

3.2 沉 降 速 率 法

3.2.1 概述

沉降速率法是一种简单、非破坏性的测定蛋白质流体力学特性的方法。它相较于凝胶色谱法的优势在于可以作为一种基本方法(不需要标准) 来测定流体力学参数。由于沉降分析法是基于第一定律，因此可以应用于其他任何方法都无法分析的系统。通过沉降速率实验获得的主要结果是沉降系数G ), 沉降系数是通过测量蛋白质的浮力质量(buoyant mass)及其摩擦系数（frictional coefficient)的比值而获得 ：

3.2.2 方法

尽管已经有一些方法可适当提高制备离心的准确度，沉降速率法最好还是用分析型超速离心机进行。分析设备的优势在于其准确度( ± 1 % 〜3 % ) 比制备型设备高了几乎一个数量级。并且 ，在整个实验过程中都可实时获得数据，因此能够观测进而更好理解任何异常行为。制备离心机的益处在于可以使用一些灵敏或特异的测量方法，如 ELISA, 因此可用于一些样品纯度未知的情况。具体方法可见分析型超速离心机的使用（R aIs t o n ,
1993)及制备离> L > 、机的使用（ Freifelder,1973; M artin an d A m es, 1961)。

如前所述，任何沉降实验的主要测量都获得了浓度关于径向位置的函数。沉降系数可以通过分子沉降距离的自然对数关于时间的函数图的斜率来确定(dlnr/由）

3.2.3 问题和局限

沉降速率法为分子生物学家提供了测量流体力学数据的最好的而且是唯一的基本方法 。电泳和凝胶过滤法都需要分子质量标准，这局限了数据解释。在本章中介绍的所有方法中，沉降分析法的问题和局限是文献记录最完整的并且最容易克服的。

沉降要求最高的方面是需要足够的用于分析的材料。如果采用标准光学系统流行的Beckman XL-A 分析用超速离心机，需 要 0. 5 m L 蛋白质浓度在0.1〜1 mg/m L 才能获得良好数据。

对于和缓冲液组分有着显著结合的蛋白质(如去污剂增溶蛋白质），沉降系数的解释会变得困难，因为结合组分将会通过4 个参数: M 、v、p、f来 影 响s的 测 量 。这 4个 参 数中 ，M 、v、f 通常最易受结合组分的影响，而且不同于沉降平衡法，沉降速率法无法「取消」这些组分的影响。因此，测得的沉降系数是这种带有结合组分的蛋白质复合物很难从中提取出蛋白质本身的信息。

3.2.4 衍生方法

蛋白质浓度对S 的影响可以通过测量不同蛋白质浓度的s 值来评价。一般来说, 随着蛋白质浓度的增加呈现近似的线性减少。

另一个应用广泛的用于估计蛋白质分子质量的方法的是，由 M a rtin和 Ames (1961)引入的蔗糖浓度梯度沉降法。这个方法，利用悬挂吊式离心桶在溶液中得到一个蔗糖线性梯度。蔗糖浓度通常在离心管顶部约5 % ，离 心 管 底 部 2 0 % 。实际浓度范围不如梯度的线性和可重现性重要。将未知样品铺在一个梯度上方，然后将一系列已知分子质量的标准蛋白质铺在另一与之平衡的梯度上。离心过程需要一定时间（一 般 12〜24 h)，然后将位于不同梯度上的物质分组分收集。这些分离组分中的蛋白质浓度可通过光谱光度测量法、酶法或其他测定方法来测定。

本方法基于一个事实，即在线性蔗糖梯度中，分子移动的距离在给定速率下是关于离心时间的一个线性函数。除此之外，这个距离与s 也线性相关，未知蛋白质移动的距离和标准蛋白质移动的距离比值, 等于它们沉降系数的比值。而沉降系数近似等于分子质量比值的2/3次方。这个方法仅能得到s 和 M 的近似值，但是很简单，不需要特殊设备，而且如果采用合适的方法可以估计非常少量材料的s、M 。

3.3 凝 胶 过 滤（分 子 排 阻）色谱法

3.3.1 概述

凝胶过滤色谱法是用于估计蛋白质分子质量的最高效、最简单的方法之一。由于这种方法能够分离样品，并且可以应用特异测定目标蛋白质的方法(如酶学和免疫方法），因此样品纯度不需要太高。这种方法是非破坏性的，可以在相当短的时间内完成，并且具有中等的准确度，只要目标蛋白质的形状与用于校准分析柱的蛋白质标准大致一致即可(Ackers，1970)

凝 胶 色 谱 法 测 定 蛋 白 质 分 子 质 量 依 赖 于 未 知 蛋 白 质 和 一 些 分 子 质 量 已 知 的 蛋 白 质 标准 的 洗 脱 体 积 之 间 的 比 较 。通 过 蛋 白 质 标 准 分 子 质 量 的 对 数 值 和 洗 脱 体 积 (或 K av，见下述 )的 函 数 图 来 估 计 未 知 蛋 白 质 的 分 子 质 量 。（值 得 注 意 的 是 ，实 际 的 依 赖 因 素 是 有 效 水合 半 径 的 对 数 值 ，或 称 蛋 白 质 的 「斯 托 克 斯 半 径 」 [(Stokes radius) ，如 能 将 蛋 白 质 标 准 拟合 至 该 变 量 则 更 佳 ]。蛋 白 质 标 准 的 洗 脱 体 积 (elution volume，V e)应 该 覆 盖 从 无 效 体 积(void volume，V 。；固 定 相 外 的 体 积 )到 内 部 体 积 (included volume，％ ; 固定相孑L 中 可 进 人的 体 积 )的 范 围 。尽 管 本 部 分 讨 论 涉 及 洗 脱 体 积 ，但 是 绝 大 部 分 S E C 的 数 据 报 告 都 采 用洗 脱 时 间 。在 给 定 流 速 下 ，洗 脱 时 间 和 洗 脱 体 积 成 比 例 。而 蛋 白 质 行 为 的 柱 非 依 赖 性 测量 值 K av，比 起 简 单 的 洗 脱 体 积 来 说 ，更 有 利 于 结 果 的 比 较 。

3.3.2 方法

操 作 原 理 及 凝 胶 介 质 和 凝 胶 多 孔 性 的 选 择 已 有 详 细 介 绍（Stellw a g e n , 2009)。 目前已 有 能 分 离 非 常 广 泛 分 子 大 小 范 围 的 S E C 固 定 相 介 质 , 但 可 能 分 辨 率 无 法 满 足 特 定 需求 。在 一 些 情 况 下 ，测 量 范 围 小 的 固 定 相 可 以 提 供 很 高 的 分 辨 率 ，但 是 选 择 时 需 考 虑 目 标蛋 白 质 的 大 小 在 凝 胶 的 分 离 范 围 内 。通 常 ，只 要 蛋 白 质 无 法 和 基 质 结 合 ，固 定 相 的 选 择 就较 为 随 意 。如 果 在 给 定 的 多 孔 性 需 求 时 有 多 种 凝 胶 颗 粒 可 以 选 择 , 应 该 用 最 小 颗 粒 ，因为这 将 提 高 柱 的 分 辨 率 。需 査 阅 制 造 商 手 册 注 意 有 关 溶 剂 的 任 何 限 制 ，但 是 一 般 来 说 ，几乎任 何 一 种 自 由 流 动 (free_fl〇 wing)含 水 缓 冲 液 系 统 都 可 采 用 。建 议 使 用 中 等 离 子 强 度 缓冲 液 ，可 将 蛋 白 质 与 基 质 静 电 相 互 作 用 减 到 最 小 。要 想 得 到 最 好 的 结 果 和 最 高 的 分 辨 率 ，应 使 用 细 长 的 柱 子 。柱 子 的 准 备 、柱 子 的 缓 冲 液 平 衡 及 流 速 的 选 择 都 应 按 照 制 造 商 的 说明 。通 常 流 速 越 低 ，分 辨 率 越 高 ，因 为 溶 质 可 以 随 时 和 凝 胶 基 质 充 分 平 衡 , 但 如 果 流 速 太慢 则 会 导 致 过 度 扩 散 并 影 响 到 分 辨 率 。所 有 样 品 应 该 在 平 衡 柱 子 所 用 的 相 同 的 缓 冲 液中 。上 样 的 样 品 体 积 应 该 少 于 柱 床 体 积 的 2 % 。除 此 之 外 , 整 个 分 析 过 程 中 柱 子 的 流 速应 该 保 持 恒 定 ，从 而 根 据 流 速 来 预 计 洗 脱 体 积 (Ackers, 1970)。
洗 脱 体 积 (V 6) 是 从 柱 子 上 洗 脱 下 来 的 体 积 ，从 一 半 的 样 品 流 过 凝 胶 床 的 顶 部 开 始 计算 ，直 到 目 标 蛋 白 质 最 大 值 (峰 )被 洗 脱 下 来 。柱 子 无 效 体 积 ( V 。）可 以 使 用 商 品 化 的 大 小不 一 的 葡 聚 糖 蓝 (M ==2 000 000)测 量 ，并 在 540 n m 或 280 n m 波 长 下 监 测 流 穿 液 。 内部体 积 ( V _i) 可 以 利 用 处 于 不 同 p H 或 电 导 (应 避 免 极 端 条 件 影 响 柱 子）的 缓 冲 液 作 为 样 品 ，或 者 包 含 少 量 染 料 (如 溴 酚 蓝 )来 测 量 。 内 部 体 积 是 小 分 子 的 洗 脱 体 积 和 利 用 无 法 进 入 凝胶 的 大 分 子 测 得 的 无 效 体 积 ( V ₀) 的 差 值 。在 选 择 染 料 时 要 格 外 注 意 ，因 为 许 多 芳 香 族 化合 物 与 固 定 相 具 有 亲 和 性 ，这 将 会 导 致 异 常 的 高 K av 值 和 V _i值 。

蛋白质标准的分子质量应覆盖所选固定相的可分 离 范 围 ，以保证 被 分 析 的 蛋 白 质 的分子质量在标准之内。要想达到最好的结果，至 少 使 用 4 种 不 同 标 准 。 已有商品化含预染蛋白质的试剂盒。任何能够简单地检测目标蛋白质的分析方法都可用到。无论什么原因只要柱子需要重装，都需重新校准柱子。

使用柱色谱法(column chromatography)测 量 变 性 蛋 白 质 的 分 子 质 量 会 有 一 些 特 殊问 题 (Fish, 1978)。这 个 方 法 假 定 未 知 蛋 白 质 的 形 状 与 标 准 蛋 白 质 的 相 同 ，这意味着蛋
白质需要完全变性，包括还原二硫键。因此缓冲液应该是包含还原剂或巯基的烷基化物，从而防止二硫键再次形成。标准品和未知样品都应经过同样处理和在同样的缓冲液条件下 分 析 。校正过程如上所述。这一方法并不常用。

3.3.3 问题和局限

使用凝胶排阻色谱法测定分子大小时，误 差 的 最 主 要 来 源 是 未 知 样 品 的 大 小 和 密 度与蛋白质标准品的差异。由于蛋白质标 准 品 一 般 都 是 致 密 的 球 状 蛋 白 ，这意味着纤维状蛋白质或者含纤维状区域的蛋白质，在 凝 胶 柱 上 的 行 为 将 会 不 规 则 。这种分子不对称性的标志之一就是，分析时减小流速, 未知蛋白质的K av值 却 升 高 ，而 蛋 白 质 标 准 品 的 K av值却 保持不变

由于这种技术测定的是蛋白质的大小而不是分子质量，因此如果用来 估 计 能 与 其 他分子形成复合物的蛋白质(如去污剂增溶蛋白质、广泛糖基化蛋白质)的分子 质 量 时 ，结果将 不 可 靠 。最 后 ，如果蛋白质与固定相之间有亲和(蛋白质表现偏小)或相斥（蛋白质表现偏 大 )相 互 作 用 ，都会导致不准确的结果。可 以 使 用 两 种 不 同 化 学 类 型 的 固 定 相 (如琼脂糖 、丙烯酰胺)测定分子质量，或者 改 变 缓 冲 液 条 件 ，从 而 检 测 蛋 白 质 与 柱 子 的 相 互 作 用 -如果有极端的相互作用,K av将会明显表现出不可接受的异常值。如 果 K av> l ，表面蛋白能与柱 子 结 合 ，此时应该用不同固定相。相 反 ，如 果 K a < 0 , 柱子此时已无法起到排阻作用 ，亟需重装并重新校正或更换。

虽然使用凝胶过滤测量分子质量的准确度通常不高, 但分子排阻色谱和光散射法联用 功 能十分强大，并且目前应用非常广泛(见下文）。这 种 情 况 下 ，凝胶过滤用于通过大小分 离 样 品 。

3.4 电泳法

3.4.1 概述

目前应用最为普遍的测定蛋白质分子大小的方法是电泳法。电 泳法简单，成 本 低 ，快速且能够测定蛋白质的范围非常广, 准确度足够满足许多需求。因此, 被用于大多数蛋白质 系 统 ，并且几乎总是在性质研究中使用。 S D S 凝 胶 电 泳 是 应 用 最 广的测定变性蛋白质表观分子质量的方法(Garfin，2009)，但是研究 分 子 大 小 、形 状 和 分 子 质 量信息的电泳法并不仅限 于 此 。例 如 ，不 一 定 要 加 S D S 到 凝 胶 中 ，尽管它应用普遍; 几乎在任何缓冲液条件中都可以完成蛋白质样品的非变性凝胶电泳。而 且 ，目前染色方法的灵敏度使得电泳法可应用于量非常少的蛋白质样品(Garfin，2009)。

3.4.2 方法

基 本 步 骤 与 前 面 (Rhodes and Laue, 2009; Garfin, 2 0 0 9 )所 介 绍 的 变 性 蛋 白 质 电 泳法 相 同 ，除 了 缓 冲 液 组 分 是 据 研 究 者 的 需 求 而 定 外 。这 里 有 一 些 限 制 ，虽 然 胶 同 样 是 在 变性 条 件 下 ，但 胶 制 备 用 的 缓 冲 液 不 能 包 含 还 原 剂 。除 此 之 外 ，由 于 蛋 白 质 暴 露 的 环 境 可 能影 响 其 电 荷 、结 合 或 形 状 ，凝 胶 中 缓 冲 液 的 组 成 需 要 仔 细 控 制 。 因 此 , 必 须 谨 慎 考 虑 催 化剂 的 相 对 比 例 , 保 证 在 凝 胶 中 没 有 过 量 氧 化 剂 残 留 。预 制 凝 胶 并 不 昂 贵 且 通 常 具 备 较 好的 质 量 控 制 ，但 是 也 很 难 保 证 其 中 缓 冲 液 的 组 分 完 全 是 实 验 所 需 组 分 。常 用 的 最 简 单 的方 法 是 预 电 泳 以 去 除 任 何 可 能 的 聚 合 产 生 的 副 产 物 。或 者 ，如 果 凝 胶 设 备 的 几 何 构 造 能
够 允 许 胶 板 暴 露 (如 水 平 或 垂 直 胶 板 ，两 个 玻 璃 板 中 的 一 个 可 以 移 动 或 者 稍 后 替 换），在电泳 之 前 可 用 需 要 的 缓 冲 液 透 析 凝 胶 。 由 于 通 常 胶 板 相 当 薄 ，数 小 时 的 透 析 一 般 足 够 。透析 也 可 以 用 来 在 凝 胶 聚 合 后 引 人 还 原 剂 ，或 者 用 不 同 缓 冲 液 条 件 下 透 析 同 时 制 备 的 一 组凝 胶 (这 样 可 假 定 胶 的 孔 隙 一 致）。

蛋 白 质 大 小 的 电 泳 分 析 基 于 一 个 简 单 的 原 理 : 电 场 中 一 个 荷 电 粒 子 , 在 正 比 于 所 带 电荷 和 所 处 电 场 强 度 的 力 作 用 下 穿 过 周 围 的 介 质 ，并 受 与 速 率 、粒 子 半 径 及 介 质 黏 度 成 正 比的 摩 擦 力 作 用 。与 S D S 凝 胶 电 泳 相 同 , 研 究 者 可 通 过 控 制 凝 胶 基 质 的 孔 隙 来 控 制 黏 度 。另 外 ，在 非 变 性 条 件 下 ，由 于 电 泳 运 行 时 p H 引 起 的 蛋 白 质 固 有 电 荷 的 改 变 , 将 显 著 影 响
蛋 白 质 迁 移 。这 个 差 异 非 常 重 要 ，在 S D S 凝 胶 电 泳中 ，电 荷 主 要 由 与 蛋 白 质 结 合 带 负 电荷 的 S D S 决 定 ，样 品 总 是 从 凝 胶 的 负 极 向 正 极 迁 移 。在 非 变 性 电 泳 中 ，迁 移 的 方 向 取 决于 缓 冲 液 的 p H 与 蛋 白 质 的 等 电 点（pi) 的 关 系 。如 果 蛋 白 质 等 电 点 未 知 (并 且 样 品 量 非常 有 限 ，不 允 许 通 过 等 电 聚 焦 实 验 检 测），可 以 使 用 水 平 电 泳 设 备 ，这 样 起 始 孔 在 凝 胶 的 中
间 。否 则 ，可 使 用 相 关 蛋 白 质 的 等 电 点 来 进 行 「最 佳 估 计 」。

迁 移 性 同 样 会 受 到 所 选 缓 冲 液 条 件 的 影 响 。改 变 缓 冲 液 条 件 可 影 响 蛋 白 质 结 合 或 导致 构 象 改 变 ，但 除 此 之 外 ，在 指 定 P H 下 不 同 蛋 白 质 的 相 对 迁 移 率 通 常 是 相 当 恒 定 的 。然而 绝 对 迁 移 率 受 平 衡 离 子 浓 度 的 影 响 非 常 大 。对 于 非 变 性 凝 胶 电 泳 迁 移 率 数 据 的 分 析 类 似 于 S D S 凝 胶 电 泳 ( S D S gel) 。唯 一 的 显
著 区 别 在 于 ，在 非 变 性 系 统 中 ，不 能 假 定 蛋 白 质 有 相 同 的 电 荷 密 度 , 也 不 能 假 定 蛋 白 质 都为 长 杆 形 状 。正 如 凝 胶 排 阻 色 谱 法 一 样 ，有 必 要 比 较 样 品 和 一 系 列 标 准 品 的 迁 移 性(Rodbard and C h r a m b a c h ，1971)。弗 格 森 分 析 (Ferguson analysis)方 法 可 以 用 来 鉴 定 区分 两 个 组 分 特 性 (大 小 和 /或 电 荷），并 且 能 够 在 无 筛 分 效 应 时 推 断 预 期 迁 移 性 (A n d r e w s ,
1986)。弗 格 森 曲 线 的 斜 率 (相 对 迁 移 率 的 对 数 值 i?f，相 对 于 胶 浓 度）和 斯 托 克 斯 半 径 rs成 比 例 。用 这 种 关 系 插 值 推 理 未 知 的 G 比 起 其 他 方 法 更 可 靠 ，如 用 关 于 标 准 品 分 子 质 量的 弗 格 森 曲 线 斜 率 。分 析 过 程 仅 涉 及 用 一 组 不 同 整 体 浓 度 凝 胶 (至 少 5 个 )电 泳 分 析 未 知蛋 白 质 和 一 些 标 准 品 ，然 后 将 风 对 数 值 对 所 有 标 准 品 和 未 知 蛋 白 质 的 胶 浓 度 作 图 。作 标准 品 的 斜 率 关 于（已 知 V s 的 函 数 图 ，未 知 样 品 的 rs 从 这 个 曲 线 和 测 量 所 得 斜 率 中 获 得 。所 用 凝 胶 的 浓 度 范 围 取 决 于 研 究 蛋 白 质 的 大 小 ，但 是 在 某 些 浓 度 上 限 ，蛋 白 质 不 能 进 人 胶中 。此 时 应 使 用 一 组 浓 度 跨 度 小 的 凝 胶 ，减 小 覆 盖 范 围 。

3.4.3 问题和 局 限
尽 管 在 很 多 种 不 同 条 件 下 ，非 变 性 条 件 电 泳 都 可 以 提 供 关 于 蛋 白 质 物 理 特 性 的 信 息 ，但 是 需 认 识 到 ，这 是 一 种 区 带 方 法（Kinal method) , 并 且 浓 度 的 影 响（或 者 稀 释 效 应 的 影响 )非 常 大 。因 此 一 般 不 推 荐 使 用 该 方 法 进 行 结 合 行 为 的 定 量 研 究 。

同 凝 胶 排 阻 色 谱 法 一 样 , 这 不 是 一 个 基 础 方 法 : 它 取 决 于 合 适 标 准 品 的 选 择 。标准品通 常 是 球 状 的 未 经 修 饰 的 可 溶 蛋 白 质 。 因 此 ，当 该 方 法 用 于 分 析 具 有 高 度 不 对 称 性 的 蛋白 质 ，或 者 有 着 独 特 的 非 蛋 白 质 修 饰 的 蛋 白 质 时 ，将 会 产 生 错 误 的 结 果 。弗 格 森 分 析 可 以帮 助 解 释 由 电 荷 差 别 导 致 的 迁 移 性 的 差 异 ，但 是 过 大 的 电 荷 密 度 将 会 产 生 异 常 的 结 果 。

由 于 在 非 变 性 凝 胶 电 泳 中 缓 冲 液 条 件 可 由 不 同 研 究 者 选 择 ，因 此 变 化 很 大 。应 该 注意 溶 液 中 负 责 产 生 电 流 的 组 分 。高 离 子 强 度 可 能 导 致 蛋 白 质 流 动 异 常 缓 慢 ，而 低 离 子 强度 缓 冲 液 可 以 使 蛋 白 质 在 非 常 低 的 电 流 情 况 下 正 常 电 泳 。鉴 于 这 种 多 变 性 ，并 且 由 于 蛋白 质 完 整 性 更 重 要 ，应 该 尤 其 注 意 功 耗 并 注 意 去 除 凝 胶 中 产 生 的 热 量 。

3.5 黏度

所 有 变 量 中 ，溶 液 黏 度 取 决 于 存 在 的 任 何 溶 质 的 量 和 性 质 。剪 切 力 下 溶 液 中 的 颗 粒的 响 应 将 取 决 于 颗 粒 的 摩 擦 系 数 ，摩 擦 系 数 代 表 着 颗 粒 与 运 动 中 溶 液 的 机 械 作 用（Y a n g ,1961)。颗 粒 的 反 应 同 样 取 决 于 颗 粒 的 质 量 ，质 量 决 定 着 获 得 给 定 运 动 所 需 的 能 量
(Y a n g ，1961)。 由 于 蛋 白 质 内 在 黏 度 很 大 程 度 上 取 决 于 分 子 不 对 称 性 ，因 此 黏 度 测 量 是蛋 白 质 形 状 的 一 个 非 常 灵 敏 的 指 标 。此 外 , 可 以 将 黏 度 数 据 与 沉 降 数 据 结 合 从 而 计 算 蛋白 质 分 子 质 量 。有 很 多 不 同 的 流 变 学 测 量 装 置 ，它 们 的 使 用 相 当 简 单 ，但 是 必 须 在 严 格 对照 条 件 下 完 成 。

3.6 场流分离法

场 流 分 离 法（field-flow fractionation,F F F ) 是 以 在 一 窄 带 通 道（narrow channel)(100〜 500 um )中 ，目 标 粒 子 处 于 与 层 流 方 向 垂 直 的 力 场 作 用 为 基 础 的 方 法（Liu et al. ，2006) 。 由 于 通 道 中 层 流 呈 抛 物 线 形 ，中 间 的 流 速 最 快 ，边 缘 流 速 最 低 , 受 外 力 影 响 最 大 的分 子 离 通 道 边 缘 更 近 ，并 且 运 动 更 慢 ，而 未 离 开 中 心 的 分 子 运 动 则 较 快 。这 个 施 加 到 分 子上 的 外 力 可 能 是 通 过 离 心 、电 泳 、磁 力 或 机 械 流 动 产 生 。横 向 流 方 法 最 常 用 ，称 为 流 动 场场 流 分 离 (flow-F F F ，f F F F ) 。这 一 方 法 中 ，半 透 膜 能 使 溶 剂（而 非 蛋 白 质 )流 出 通 道 底 部 ,如 此 产 生 了 一 个 浓 度 梯 度 , 使 通 道 底 部 的 浓 度 高 于 顶 部 和 中 部 。为 对 抗 该 浓 度 梯 度 产 生的 扩 散 作 用 ，小 分 子 更 快 地 扩 散 到 流 速 快 的 通 道 中 部 。大 分 子 扩 散 较 慢 因 而 在 通 道 边 缘缓 慢 运 动 。

这 种 方 法 的 优 势 在 于 其 非 破 坏 性 ，并 且 在 任 何 缓 冲 液 体 系 中 都 可 以 用 。只 要 调 整 合适 的 流 速 ，这 一 方 法 能 够 分 辨 的 分 子 大 小 范 围 非 常 广 。 目 前 的 仪 器 使 用 高 效 液 相 色 谱 部件 和 高 自 动 化 系 统 ，使 得 该 过 程 更 加 简 便 。一 个 标 准 的 实 验 过 程 仅 需 30 m i n 。虽 然 如此 ，这 个 方 法 还 是 充 满 了 技 术 挑 战 ，并 且 需 要 一 定 时 间 和 努 力 来 促 进 方 法 发 展 。最 后 ，这个 方 法 非 常 适 合 于 分 辨 不 同 大 小 的 分 子 (单 体 、二 聚 体），但 是 粒 径 分 布 结 果 是 相 对 的 ，很维 分 离 。尽 管 这 一 方 法 还 在 起 步 阶 段 , 但 随 着 该 方 法 的 逐 步 成 熟 ，已 经 备 受 关 注 并 在 蛋 白质 纯 度 分 析 中 寻 得 了 一 席 之 地 。

3.7.2 问题和 局 限

解 释 M S 数 据 时 最 重 要 的 因 素 是 要 理 解 结 果 的 来 源 。例 如 ，出 现 2 2 、4 4 、6 6 或 8 8 质量 漂 移 是 由 于 钠 的 加 成 ，N a + 置换了 H ‘ 但 是 保 持 整 体 电 荷 状 态 。类 似 的 ,3 9 质 量 漂 移是 钾 加 成 信 号 ，铵 的 加 成 (质 量 漂 移 为 I7)也 能 观 察 到 。使 用 超 纯 溶 剂 可 以 将 这 种 加 成 减低 到 最 小 ，但 是 很 难 完 全 去 除 。

由 于 这 种 方 法 报 告 的 是 m/z ，因 此 理 论 上 ，单 体 和 双 倍 电 荷 的 二 聚 体 没 有 任 何 区 别。虽 然 电 荷 去 卷 积 算 法 不 能 解 决 这 个 问 题 ，除 T O F 外 的 质 谱 仪 却 可 以 。例 如 ，傅 里 叶 变 换离 子 回 旋 加 速 器 (F T IC R M S )及 离 子 阱 质 谱 仪 的 超 高 质 量 分 辨 能 力 可 通 过 离 子 的 同 位 素峰 测 定 电 荷 状 态 ，从 而 解 决 这 种 不 确 定性 。这 些 质 谱 仪 可 以 清 楚 地 区 分 单 电 荷 单 体 和 双倍 电 荷 的 二 聚 体 。也 可 通 过 稀 释 样 品 至 无 法 观 测 到 二 聚 体 而 最 小 化 二 聚 体 的 形 成 。如果配 体 结 合 较 强 以 致 稀 释 都 无 法 分 开 ，则 可 使 用 较 高 浓 度 的 有 机 溶 剂 、酸 或 者 二 者 结 合 来 解离 非 共 价 复 合 物 。对 酸 敏 感 的 去 污 剂 可 以 用 来 初 步 分 离 非 共 价 复 合 物 , 但 是 一 旦 p H 较低 ，这 些 去 污 剂 会 解 离 成 互 不 干 扰 的 不 稳 定 的 单 体 。

类 似 的 , 如 没 有 额 外 信 息 ，单 峰 可 能 来 自 一 个 宽 范 围 的 荷 质 组 合 。幸 运 的 是 ，对 于 蛋白 质 来 说 , 正 常 观 测 到 的 多 电 荷 状 态 可 通 过 去 卷 积 得 到 明 确 的 结 果 。存 在 结 合 紧 密 的 配体 会 有 一 定 问 题 ，但 是 可 以 靠 改 变 P H 、增 加 溶 液 中 有 机 溶 剂 含 量 或 者 稀 释 溶 液 直 到 复 合物 分 离 。

对 于 一 些 蛋 白 质 电 喷 雾 过 程 不 足 以 得 到 有 用 的 信 号 ，如 E S I 很 难 电 离 非 常 大 的 蛋 白质 ( > 1 5 0 k D a ) 。 E S I 也 对 基 质 敏 感 ，如 高 盐 浓 度 溶 液 会 减 弱 信 号 。这 种 情 况 下 可 采 用 替代 的 电 离 模 式 。 M A L D I 在 这 些 情 况 下 很 适 用 ，因 为 这 种 模 式 可 以 处 理 非 常 大 (I M D a )的蛋 白 质 ，并 且 能 耐 受 高 盐 浓 度 。色 谱 分 离 后 对 单 独 的 色 谱 峰 用 冻 干 法 , 可 用 于 L C /M A L -
D I 分 析 。 M A L D I 趋 向 于 形 成 单 电 荷 离 子 ，所 以 蛋白 质 离 子 很 大 程 度 上 可 观 测 到 它 们 的[M + 1 H ]’•峰。这 可 以 简 化 谱 图 分 析 ，因 为 二 聚 体 峰 会 表 现 为 2 倍 的 m /z ，这 就 完 全 避 免了 2 倍 电 荷 二 聚 体 问 题 。

质 谱 法 受 到 了 一 定 限 制 ，因 为 蛋 白 质 通 常 并 非 仅 含 一 种 同 位 素 。蛋 白 质 中 13C 、15N 、:『S 或 其 他 同 位 素 的 存 在 会 使 蛋 白 质 量 增 加 , 这 会 导 致 较 宽 的 T O F 质 量 谱 图 峰 。这 种 增宽 最 终 会 使 蛋 白 质 离 子 的 m /z 分 子 质 量 包 络 加 宽 ，从 而 导 致 蛋 白 质 分 子 质 量 的 不 确 定 。此 时 , 会 难 以 辨 认 由 于 形 成 加 成 物 、结 合 配 体 、二 聚 体 或 多 聚 体 形 成 导 致 的 峰 。尽 管 这 一问 题 在 6〜 7 M D a 以 下 通 常 不 明 显 ，但 是 它 确 实 为 该 方 法 设 定 了 上 限 。这 个 问 题 在 一 些研 究 中 可 以 避 免 。例 如 ，用 氨 基 酸 或 其 他 去 除 同 位 素 的 初 始 物 来 制 造 蛋 白 质 —它 们 所含 的 13C,15N ,S 等 类 似 同 位 素 比 天 然 的 同 位 素 丰 度 低 。

同 时 要 提 及 的 是 ，利 用 基 于 质 谱 方 法 优 势 的 同 时 需 付 出 相 应 的 成 本 。截 至 笔 者 书 写时 ,T O F 设 备 需 250 000〜 500 0 0 0 美 元 ，而 F T M S 设 备 约 需 要 2 000 0 0 0 美 元 。

四、散 射 方 法

光 散 射 法（light scattering method) 通 常 用 来 获 得 分 子 质 量 和 回 转 半 径（radius 〇£ gyration) ，但 是 特 定 的 散 射 法 能 够 提 供 扩 散 系 数 、分 子 质 量 及 热 力 学 参 数（C h u ，1974;Cottingham，2005; T i m a s h e f f a n d T o w n e n d , 1970)。主 要 的 光 散 射 方 法 所 用 仪 器 已 经发 展 到 可 以 与 H P L C 和 F F F 设 备 结 合 ，并 几 乎 纳 入 了 所 有 数 据 分 析 功 能 。应 用 简 单 和可 及 性 使 得 这 些 强 有 力 的 蛋 白 质 鉴 定 方 法 再 度 流 行 。

光 散 射 法 的 基 础 是 , 入 射 光 振 荡 电 磁 场 与 蛋 白 质 中 电 子 作 用 ，产 生 振 荡 偶 极 子 。这些振 荡 偶 极 子 发 射 光 线 ，其 强 度 和 方 向 取 决 于 许 多 因 素 ，包 括 分 子 的 大 小 和 结 构 。

Zimxn 关 系 构 成 了 现 在 称 为 「静 态 」光 散 射 的 基 础 。

和 光 散 射 法 鉴 定 同 一 个 蛋 白 质 ，可 以 通 过 比 较 来 验 证 任 何 假 设 的 有 效 性 。强 大 、重复 性 好和 易 于 操 作 的 特 点 使 SEC-多 角 度 光 散 射 法（SEOmultiple——angle light scattering,SECM A L S ) 成 为 制 药 工 业 鉴 定 蛋 白 质 聚 集 体 的 主 要 方 法 (Wen et al. ， 1996)。

如 果 光 散 射 法 未 与 色 谱 分 离 联 用 —色 谱 法 本 身 能 够 提 供 非 常 有 效 的 过 滤 ，即 需 要保 持 非 常 严 格 的 条 件 避 免 溶 液 中 出 现 「灰 尘 」。有 非 常 少 量 的 大 颗 粒 存 在 就 能 轻 易 控 制 散射 信 号 ，妨 碍 结 果 。但 这 种 依 赖 性 也 反 映 了 这 一 方 法 检 测 大 的 蛋 白 质 聚 合 或 复 合 物 的
能 力 。

4.1 电子显微镜

电 子 显 微 镜 (electron microscopy)是 一 种 直 接 成 像 法 ，因 此 一 直 以 来 都 是 一 种 测 定 大蛋 白 质 或 亚 基 复 合 物 分 子 大 小 和 形 状 的 具 有 吸 引 力 的 方 法 ，。这 一 领 域 中 最 初 的 工 作 是用 来 鉴 定 大 复 合 物 ，如 血 蓝 蛋 白 质 复 合 物 的 形 状 (van Bruggen and W i e b e n g a , 1962)，后来 发 展 到 膜 蛋 白 晶 体 阵 列 成 像 (Sletyr et al. ， 1988)，而 最 近 用 来 对 蛋 白 质 结 构 进 行 冷 蚀刻 电 子 显 微 镜 (cryo-E M )分 析（Topf and Sali， 2005; Topf etal. ， 2008)。 本 方 法 提 供 了分 子 天 然 大 小 和 形 状 的 详 细 信 息 ，并 且 尤 其 适 用 于 与 许 多 分 析 方 法 不 相 容 的 膜 相 关 蛋 白质 分 析 。电 子 显 微 镜 的 分 辨 率 本 身 有 一 定 限 制 ，但 是 通 过 低 温 制 备 和 将 大 量 图 片 信 号 平均 ，可 以 获 得 高 分 辨 率 的 电 子 密 度 图 。密 度 图 可 与 结 构 填 充 算 法 结 合 获 得 蛋 白 质 分 子 的详 细 结 构 图 。这 一 模 型 需 要 对 蛋 白 质 序 列 有 所 了 解 ，因 此 不 是 一 个 可 以 通 过 实 验 测 定 蛋白 质 分 子 质 量 的 方 法 ，但 却 是 一 个 巧 妙 的 高 分 辨 率 测 定 分 子 大 小 和 形 状 的 手 段 。尽 管
cryo-E M 法 不 是 一 个 实 验 室 常 用 的 测 定 蛋 白 质 大 小 的 技 术 , 但 其 大 大 促 进 了 以 前 研 究 异常 困 难 的 蛋 白 质 科 学 领 域 的 进 展 。

五、蛋 白 质 亚 基 的 存 在

为 测 定 是 否 存 在 亚 基 ，通 常 需 要 在 易 于 聚 集 和 可 能 促 进 解 离 的 条 件 下 鉴 定 一 个 或 多个 系 统 的 特 性 。因 此 ，研 究 者 应 当 对 于 适 合 蛋 白 质 聚 集 或 解 离 的 条 件 有 初 步 了 解 ，或者需要 调 査 很 多 已 被 证 明 在 其 他 情 况 下 导 致 解 离 的 条 件 。找 到 合 适 的 条 件 可 能 需 要 研 究 者 付出 大 量 劳 动 ，但 如 果 计 划 得 当 ，也 会 得 到 许 多 关 于 系 统 特 性 的 额 外 信 息 。在 开 展 有 关 聚 集或 解 离 条 件 的 深 度 寻 找 之 前 , 采 用 极 端 的 条 件 作 为 初 步 的 探 索 非 常 有 用 。通 常 可 先 在 一些 (一 般 是 生 理 性 的 ) 缓 冲 液 中 进 行 分 离 实 验 ，然 后 在 强 变 性 条 件 下 重 复 。

一 种 非 常 简 单 、快 速 ，而 且 低 成 本 的 研 究 亚 基 的 方 法 ，可 采 用 先 在 非 变 性 条 件 下 进 行电 泳 ，此 时 使 用 的 缓 冲 液 与 蛋 白 质 被 分 离 时 所 有 缓 冲 液 相 同 ，随 后 在 解 离 或 变 性 条 件 下 进行 第 二 维 电 泳 。变 性 条 件 的 性 质 取 决 于 亚 基 的 种 类 和 预 期 能 够 发 现 的 结 合 的 种 类 。例如 ，第 二 维 电 泳 可 以 在 极 端 p H 、含 尿 素 或 S D S 、加 或 不 加 其 他 缓 冲 组 分 (如 钙）的 条 件 下进 行 。缓 冲 液 条 件 改 变 而 导 致 的 迁 移 率 改 变 应 该 通 过 分 析 第 二 维 来 解 释 和 理 解 。也 就 是说 ，分 析 应 该 基 于 在 结 合 和 可 能 的 解 离 缓 冲 液 条 件 下 的 分 子 表 观 大 小 。如 果 需 要 研 究 二硫 键 亚 基 存 在 的 可 能 性 ，可 采 用 无 还 原 剂 的 S D S 凝 胶 电 泳 作 为 第 一 维 ，含 还 原 剂 的 S D S凝 胶 电 泳 作 为 第 二 维 。 由 于 胶 内 二 硫 化 物 烷 化 很 困 难 ，因 此 推 荐 在 二 次 电 泳 缓 冲 液 中 加人 巯 基 乙 酸 盐 以 避 免 再 氧 化 。表 观 分 子 质 量 的 差 异 或 者 在 第 二 维 中 出 现 多 个 组 分 都 预 示着 存 在 二 硫 键 亚 基 。通 过 非 变 性 电 泳 推 断 出 的 表 观 分 子 质 量 差 距 ，与 在 完 全 变 性 条 件 下(S D S ——P A G E ) 电 泳 得 到 的 表 观 分 子 质 量 相 比 较 ，也 能 够 预 示 亚 基 的 存 在 ，但 是 必 须 考 虑 到一 种 可 能 性 , 即 由 极 端 的 不 对 称 性 和 固 有 电 荷 引 起 的 分 子 的 电 泳 行 为 。

某 些 亚 基 可 能 处 于 结 合 和 解 离 状 态 的 平 衡 点 ，在 这 种 情 况 下 确 定 亚 基 存 在 的 最 终 手段 是 需 要 将 平 衡 状 态 转 换 到 结 合 或 者 解 离 状 态 从 而 实 验 测 量 分 子 的 表 观 大 小 。解 离 意 味着 研 究 的 样 品 需 要 极 度 稀 释 ，因 此 需 要 采 用 灵 敏 度 非 常 高 的 方 法 。

沉 降 平 衡 法 是 一 种 测 定 天 然 蛋 白 质 分 子 质 量 的 非 常 有 用 的 方 法 ，也 因 此 可 用 来 测 量亚 基 在 最 后 装 配 中 的 化 学 计 量 。这 是 通 过 将 天 然 分 子 质 量 和 在 变 性 条 件 下 (如 变 性 凝 胶电 泳 ) 进 行 分 离 实 验 获 得 的 蛋 白 质 分 子 质 量 相 比 较 而 实 现 的 。如 果 蛋 白 质 是 由 分 子 质 量一 致 的 亚 基 组 成 的 , 将 天 然 蛋 白 质 分 子 质 量 与 变 性 蛋 白 质 分 子 质 量 相 除 就 可 获 得 亚 基 的化 学 计 量 。 同 样 ，对 于 包 含 多 个 链 的 蛋 白 质 ，比 较 天 然 蛋 白 质 分 子 质 量 和 单 体 蛋 白 质 分 子质 量 的 总 和 ，常 常 能 够 测 得 天 然 复 合 物 中 不 同 亚 基 的 化 学 计 量 。但 当 遇 到 亚 基 分 子 质 量间 相 差 较 大 的 情 况 ，或 者 天 然 结 构 中 包 含 大 量 的 单 体 ，这 种 估 计 方 法 是 不 精 确 的 。

虽 然 这 里 这 一 主 题 需 要 补 充 太 多 的 细 节 ，但 是 值 得 注 意 的 是 ，沉 降 平 衡 是 测 定 质 量 行为 驱 动 大 分 子 结 合 的 结 合 常 量 的 最 有 用 的 方 法 之 一 (Johnson et al. ，1981)。本 方 法 的 实验 研 究 方 法 基 本 在 前 文 已 有 介 绍 。有 一 些 实 验 在 某 些 浓 度 下 完 成 ，该 浓 度 范 围 涵 盖 了 质量 发 生 显 著 改 变 （由 于 结 合 导 致 的 )的 情 况 ，本 章 没 有 对 这 些 实 验 进 行 介 绍 。结 合 常 量 可
用 图 解 方 法 来 估 计 ，或 者 用 非 线 性 最 小 二 乘 法 分 析 获 得 更 准 确 的 数 据（Johnson et al. ，1981)。

速 率 离 心 也 可 以 简 单 筛 选 溶 液 中 的 多 组 分 。沉 降 系 数 的 完 整 分 布 G (S) (Demder eta l.， I997) 基 于 沉 降 边 界 外 推 法（extrapolation of the sedimentation boundary)来排 除 沉降 过 程 中 的 扩 散 作 用 。这 个 方 法 是 模 型 独 立 的 ，并 且 非 常 适 合 于 测 定 一 个 样 品 中 异 质 分配 、结 合 行 为 或 者 任 何 非 理 想 特 性 。 目 前 也 已 经 研 究 出 了 一 些 类 似 的 和 相 关 的 方 法(Schuck， 2000; Stafford, 1992)。从 这 些 方 法 中 ，可以 容 易 的 比 较 单 体 、多 聚 体 以 及 多 种类 型 解 离 亚 基 的 表 观 分 子 质 量 。

凝 胶 渗 透 色 谱 法 在 测 定 亚 基 在 最 后 装 配 中 的 化 学 计 量 （stoichiometry) 时 也 很 有 用 。同 样 的 ，也 是 通 过 比 较 凝 胶 过 滤 测 定 的 天 然 分 子 质 量 和 变 性 条 件 下 (如 S D S 凝 胶 电 泳 ) 获得 的 分 子 质 量 。通 过 这 种 方 法 可 以 检 测 到 结 合 ，理 论 上 还 可 以 使 用 天 然 分 子 质 量 和 变 性分 子 质 量 的 比 值 测 量 化 学 计 量 。凝 胶 色 谱 法 对 检 测 蛋 白 质 系 统 相 互 作 用 同 样 有 效 。例 如 ，如 果 目 标 蛋 白 质 是 一 个 处于 迅 速 的 组 装 -拆 装 平 衡 状 态 的 多 亚 基 分 子 ，那 么 峰 型 将 是 不 对 称 的 。其 前 沿 将 会 非 常 陡峭 ，而 后 沿 弥 散 。 同 样 ，随 着 蛋 白 质 上 样 浓 度 的 增 加 而 增 加 的 K av值 也 通 常 暗 示 发 生 了 这种 相 互 作 用 ，并 需 要 更 加 详 尽 的 分 析 (Ackers, 1970)。