凝胶过滤实验

操作

采用分子筛层析获得的洗脱图谱如图 23.1 A 所 75。零 洗 脱 体 积 (zero elution volu m e ) 是指上样于层析固定相的样品体积。无法进入介质的分子的洗脱体积定义为无效体 积 V 。，它表示颗粒外部的体积。可以进人介质的分子的体积定义为总体积％, 它表示颗粒内部体积及外部体积的总和。介于两者之间的洗脱体积即为 V e。分配系 数 为 K av，
具体关系见式 (23.1):

蛋 白 质 分 子 质 量 决 定 分 配 系 数 ，两 者 之 间 的 半 对 数 曲 线 如 图 23.1 B 所 示 。基 于 分 子质 量 的 大 小 分 离 蛋 白 质 最 好 在 上 述 S 形 曲 线 的 中 央 线 性 区 域 ，该 区 域 涉 及 的 K av 值 为0.2〜0.8。这 一 范 围 可 以 作 为 分 子 排 阻 介 质 的 分 离 范 围 。

在 分 离 范 围 内 ,S 形 曲 线 的 斜 率 越 大 ，表 示 介 质 的 分 辨 率 越 大 。相 应 地 ，在 分 离 分 子质 量 相 似 的 蛋 白 质 时 , 最 宜 采 用 分 离 范 围 较 窄 的 介 质 。

任 何 一 种 分 子 筛 层 析 柱 可 以 只 从 流 出 液 中 分 离 的 蛋 白 质 均 少 于 1 0 种 。之所以发生这 种 较 低 的 分 辨 率 ，一 是 因 为 在 层 析 过 程 中 , 没 有 任 何 蛋 白 质 留 存 于 柱 中 ；二 是 因 为 在 颗粒 周 围 出 现 非 理 想 流 动 。因此 ，如 果 目 标 蛋 白 质 比 混 合 物 中 大 多 数 蛋 白 质 的 分 子 质 量 大或 者 小 ，就 可 能 显 著 改 善 分 子 筛 层 析 纯 化 (倍 数 ) 。 由 于 上 述 情 况 并 不 具 有 普 遍 性 ，研 究 者只 能 期 望 适 度 提 高 纯 化 (倍 数 ) 。因 此 ，在 纯 化 方 案 中 将 分 子 筛 层 析 尽 量 放 在 纯 化 程 序 的后 期 是 明 智 的 ，此 时 其 他 蛋 白 质 数 量 少 , 并 且 前 面 的 步 骤 已 经 采 用 完 全 不 同 特 性 的 方 法 对蛋 白 质 混 合 物 进 行 了 分 离 。例 如 ，经 过 离 子 交 换 层 析 合 并 的 分 离 组 分 ，很 可 能 还 是 一 个 蛋白 质 的 混 合 物 ，它 们 具 有 相 同 的 净 电 荷 ，只 是 分 子 质 量 不 同 。

1. 介质

一 些 传 统 的 高 效 分 子 筛 介 质 的 特 性 如 表 23. 1〜 表 23. 4 所 示 。需 要 注 意 的 是 ，供 应商 在 其 产 品 目 录 的 索 引 中 使 用 了 多 种 术 语 及 缩 写 ，包 括 凝 胶 过 滤 层 析 (gel-filtmtion chrom a t o g r a p h y , G F O 、凝 胶 渗 透 层 析 (gel-permeation chromatography, G P C ) 和 分 子 筛 层析（size-exclusion chromatography, S E C ) 。

传 统 介 质 具 有 经 济 性 和 流 速 慢 的 特 点 。这 些 介 质 常 以 散 装 的 形 式 销 售 , 研 究 者 可 以根 据 需 要 分 离 样 品 的 体 积 来 填 装 任 意 尺 寸 的 层 析 柱 。其 正 常 流 速 如 表 23. 2 所 示 , 体 积 流速 为 柱 横 截 面 积 (c m 2) 乘 以 线 性 流 速 (m i n /h ) 。填 装 层 析 柱 的 流 速 大 约 为 层 析 分 离 过 程中 的 5 倍 。

髙 效 介 质 具 有 使 用 方 便 、流 速 快 和 成 本 髙 的 特 点 。这 类 介 质 常 以 填 充 柱 的 形 式 销 售 ，研 究 者 通 常 可 以 采 用 已 有 的 高 效 层 析 方 法 进 行 纯 化 。较 小 的 分 析 型 层 析 柱 大 约 为 8mmX300mm，正 常 情 况 下 其 蛋 白 质 载 荷 量 为 数 毫 克 以 下 ，流 速 为 I m L /m i n 左 右 。更 大 的 制 备型 层 析 柱 的 填 充 颗 粒 的 直 径 一 般 为 30 um 。20 mm X 300 m m 左 右 规 格 的 层 析 柱 , 其 蛋 白质载荷量为 1 〇〜1 〇〇 m g ，操 作 流 速 约 5 m L /m i n 。对 于 非 常 大 的 层 析 柱 来 说 ，其 蛋 白 质 载荷 量 可 以 达 到 2 g ，流 速 可 达 30 m L /m i n 。

2.样品的制备

样 品 蛋 白 质 的 浓 度 一 般 不 应 超 过 50 m g /m L ，并 且 应 采 用 离 心 处 理 后 获 得 的 澄 清 溶液 ，如 有 必 要 ，应 以 低 流 速 上 样 防 止 不 溶 性 微 粒 形 成 。既 然 在 层 析 分 离 的 过 程 中 ，蛋 白 质预 处 理 后 才 使 用 相 关 的 溶 剂 ，那 么 该 溶 剂 的 使 用 就 是 无 关 紧 要 的 。

3. 层析用溶剂

可 以 用 于 层 析 柱 的 溶 剂 种 类 很 宽 泛 ，只 需 满 足 如 表 23. 1 中 所 示 的 系 统 规 定 的 参 数 、P H 和 温 度 等 。但 是 ，蛋 白 质 与 介 质 可 以 通 过 静 电 作 用 或 范 德 华 作 用 结 合 。为 了 将 结 合降至 最 低 ，所用 溶 剂 的 离 子 强 度 应 不 小 于 0.2 mol/L 。 由 于 大 多 数 蛋 白 质 本 身 在 室 温 下
是 比 较 稳 定 的 ，而 蛋 白 质 样 本 中 存 在 的 任 何 蛋 白 水 解 酶 都 会 催 化 多 肽 水 解 ，此 时 只 需 要 降低温度就可以减慢水解速率。然而，纯化阶段的蛋白质水解已成为日益突出的问题，因为对于蛋白酶来说，目标蛋白质富集后蛋白酶的作用底物也变得更丰富。在某些情况下，我们还需要向层析溶剂中加人较昂贵的蛋白酶抑制剂或效应物，以便维持目标蛋白质的功能 。也可以采用一些比较经济可行的方法，用含有昂贵抑制剂组分的溶剂平衡 1 个柱体积 ，之后再进行蛋白质样品上样。完成上 样 之 后 ，溶剂中便不需要加人昂贵的抑制剂组分。

在玻璃圆柱内可以用简单的溶剂进行层析柱灌装，如 采 用 含 有 〇.0 2 % 叠氮化钠的0.1 mol/L NaCl 进行平衡，可以防止微生物的生长。在不锈钢圆筒中灌装层析柱, 首选的储存溶剂为甲醇, 可以避免其中的盐溶液加速对容器的腐蚀。

4. 初筛

为了优化分子筛层析的纯化效果 (倍数），需要采用最容易分离目标蛋白质的介质。同样的，初筛可以用于估测目标蛋白质的分子质量，以及区分其他蛋白质的分子质量。除了蛋白质样品外，用于进行初筛的工具还包括分子筛层析柱、分布收集器、总蛋白质含量测定仪器、目标蛋白质含量测定仪器及蛋白质分子质量标准混合物。蛋白质总量的测定可以采用紫外分光光度法或者比色法 (见 182 卷 ，Stoscheck 所 著 第 6 章)。用于上样的蛋白质样品浓度必须足够大，这样, 洗脱液组分中目标蛋白质功能检测才具有可信性。可以推 测 ，经过层析分离之后，目标蛋白质浓度至少被稀释 1 个数量级。

蛋白质分子质量标准混合物通常称之为凝胶过滤标准，可以向一些供应商购买，包括Bio-Rad Laboratories (Richmond, C A )、 Pharmacia LKB Biotechnology (Piscataway,NJ) 和 Sigma Chemical (St. Louis， MO)。这类用于校准的混合物含有一些经过鉴定的蛋白质，它们各自的分子质量和组分均已知，且具有确定的 V。和 Vt。研究者也可以选择
已经纯化的组分作为校准混合物。葡聚糖蓝 (blue dextran) 和 DNA 限制性片段通常用于测定 V。。重要的是，不要利用小分子质量的芳香族或杂环化合物测定 Vt，因为这类分子尤其容易与分子筛层析介质发生可逆性吸附。

如有现成的高效分子筛分析柱和层析方法，那么初筛的工作将会既快速又简单。用于初筛的层析柱，其分离范围应比较宽广。在分析柱前应放置保护柱, 以便截留之前未曾注意到的颗粒性物质。可采用注射方式进行上样，这样可以保证上样体积的最小化，也适合于层析柱流出液中目标蛋白质的分析。如果溶剂的吸光度允许，应采用吸光度流量探测 仪 ，并将检测波长设置在更灵敏的 225 nm 处以监测流出液的蛋白质浓度，或者也可以设置在相对不太灵敏的 280 nm 处进行监测。若没有吸光度流量探测仪，应收集流出液组分并分析总蛋白质量及目标蛋白质量。最后 ，将凝胶过滤标准混合物采用注射上样，并以相同的波长监测流出液。比较凝胶过滤标准混合物、样品中总蛋白质及目标蛋白质的洗脱图，可方便选择介质，并通过该介质优化分子筛层析的纯化效率 (倍数)。

如没有现成的高效分析柱，那么必须采用分离范围较宽的传统介质进行初筛。一般应选择容易进行灌装成柱的介质。接下来将会详细说明以传统介质灌装层析柱。同样的, 利用凝胶过滤的标准混合物、样品总蛋白质和目标蛋白质的洗脱图进行初筛，借此来确定用于优化分子筛层析纯化的介质。

5. 传统介质层析

用于蛋白质纯化的传统介质的体积一般应为所需分离样品体积的 30〜100 倍 。将灌装所需量的介质悬浮于层析溶剂中，并将温度调节至分离操作时所需条件。悬浮液的体积不应超过预计灌装柱体积的 2 倍 。轻轻摇晃悬浮液除去细小颗粒，吸去上清液, 直至约9 0 % 颗粒已沉降稳定。最后, 将重悬物放置于负压条件下以减少溶解空气的体积。用抽滤瓶和实验室抽吸器均可以达到此目的。

如介质呈干粉状，那么在去除细小颗粒前，应先将其溶胀于层析溶剂中。该介质可以在 室 温 或 l 〇〇° C 条件下溶胀，这取决于研究者可利用的时间。如 表 23. 2 所 示 ，在不破坏介质的前提下，于 l 〇〇° C 下溶胀介质更快。

层析柱制备应在商业化设计的或实验室临时制作的玻璃或透明塑料的圆筒中进行。该圆筒长度与直径的比例一般为 20〜100。临时制作可采用如下程序。柱子的底部可以放置一个末端较窄、长度较短且较厚的橡皮塞, 同时周围以毛细管围绕。垂直放置圆筒,并将其安全地置于将进行层析分离操作的位置。将橡皮塞插人圆筒末端底部。以可弯曲的短管与突出的玻璃管连接, 并将夹卡装置附于管道上控制通过圆筒柱液体的流速。再将一个酰胺纤维或聚四氟乙烯树脂材料的网状物放入圆筒柱内部，并推至底部使其正好与橡皮塞相互接触。关紧夹卡装置，向圆筒柱中倒入介质悬浮液。过量的悬浮液则位于底部有出口和开关装置的容器，如分液漏斗中, 且该出口要以一个可弯曲的管道与圆筒柱的顶端和带有短玻璃管孔的橡皮塞相连。这种组装设备，在分液漏斗中悬浮液的表面和接于圆柱体底部的可弯曲管道间是封闭的。液体的流速通过与圆筒柱分液漏斗的相对高度进行控制。装柱时的流速可采用 5 倍 于 表 23. 2 所示的流速 。 一 旦填装好层析柱所需髙度 ，便可关闭夹子和开关, 去除多余的介质悬浮液，并以分液漏斗作为容器使层析用溶剂流穿层析柱。应使层析柱溶剂顶端一直维持在数厘米的高度，以缓冲加人层析溶剂时产生的冲击力，进而保证已经填装好的层析柱顶端不受影响。切记不要使填装好的层析柱变干，因为这样会在层析柱中形成通道，进而严重影响蛋白质的分离。

上样时应关闭开关，移除圆筒柱顶端的橡皮塞，且将汇集于圆筒柱顶端的溶剂排过层析 柱 ，直至溶剂浸人已装层析柱顶端之下。之后，关闭夹子，将样品或标准溶液小心加入，尽量减少对已装层析柱顶端的影响。接着，打开夹子，使样品溶液进入层析柱内，直至其恰好低于层析柱的顶端。再关闭夹子, 并加入少量的层析用溶剂，注意尽量减少对已装层析柱顶端的影响。溶剂进入层析柱后，再关闭夹子，加入更多的层析溶剂，以形成所需的溶剂高度。用分液漏斗供给层析溶剂, 并通过可弯曲的管道密封连接于层析柱的顶端。最后调整分液漏斗的髙度并维持所需流速。

柱后流出液的吸光度可以通过流量控制器在所需波长下进行连续监控。重要的是，层析柱底部的管状材料和监控器中的流动光学元件均应具有较小的直径，这样可以防止在层析柱中出现液体的对流混合现象。还有一点也是很重要的，所用的可弯曲管道，其材料对层析溶剂的紫外线吸光度值应无影响。另 外 ，柱后流出液还可以通过分级收集器直接收集, 之后，再进行分离组分的总蛋白质和目标蛋白质的分析检测。滴数计是可以达到这一目的的理想工具。

6. 放大

采 用 传 统 介 质 进 行 分 子 筛 层 析 很 容 易 放 大 规 模 ，可 以 增 大 柱 体 积 以 适 应 需 分 离 纯 化的 样 品 体 积 。样 品 体 积 非 常 大 时 ，相 对 于 制 备 极 大 尺 寸 层 析 柱 来 说 ，最 好 的 处 理 办 法 是 重复 层 析 。表 23. 4 所 示 为 可 购 买 的 半 制 备 用 或 制 备 用 规 模 的 髙 效 层 析 柱 ，并 且 有 些 供 应 商也 会 为 研 究 者 提 供 散 装 介 质 用 于 灌 装 层 析 柱 。尽 管 这 类 较 大 的 高 效 层 析 柱 十 分 昂 贵 ，但是 可 以 为 研 究 者 节 省 相 当 多 的 时 间 ，而 且 还 有 多 种 不 同 的 用 途 ，故 而 从 长 期 来 看 ，这 种 投资 还 是 值 得 的 。

7. 故障排除

分辨率低

分 辨 率 低 是 使 用 者 普 遍 的 感 受 ，因 为 分 子 筛 层 析 本 身 就 存 在 分 辨 率 差 的 缺 点 。虽 然如 此 , 还 是 可 以 通 过 改 变 一 些 操 作 参 数 来 提 高 分 辨 率 。首 先 ，由 于 流 速 与 分 辨 率 呈 反 相关 , 故 降 低 流 速 可 以 提 高 分 辨 率 。其 次 ，采 用 直 径 更 小 的 颗 粒 可 以 提 高 分 辨 率 。最 后 ，采用 分 离 范 围 更 窄 的 介 质 也 许 会 有 帮 助 。

流速慢
流 速 慢 通 常 是 由 于 样 品 中 存 在 的 颗 粒 物 质 堵 塞 了 过 滤 装 置 或 层 析 介 质 。处 理 方 法 ：首 先 采 用 反 向 流 清 洗 层 析 柱 ，配 以 增 溶 性 的 试 剂 ，如 离 子 型 或 非 离 子 型 的 去 污 剂 ; 蛋 白 质变 性 剂 ，如 尿 素 或 盐 酸 胍 ; 有 机 溶 剂 ，如 甲 醇 ; 或 者 在 保 证 介 质 稳 定 的 前 提 下 , 将 其 短 暂 暴露 于 强 酸 或 强 碱 。如 上 述 的 操 作 仍 不 能 达 到 效 果 ，对 于 传 统 介 质 , 建 议 拆 分 层 析 柱 ，分 别进 行 清 洗 ，之 后 再 重 装 ; 对 于 高 效 层 析 柱 ，建 议 可 将 该 层 析 柱 送 至 P h e n o m e n e x 或 其 他 供应 商 处 ，进 行 有 偿 清 理 及 重 装 ，或 者 采 用 简 单 的 方 式 用 新 的 层 析 柱 进 行 替 换 。具 有 重 装 层析 柱 设 备 的 实 验 室 也 可 自 己 进 行 清 洁 并 重 装 高 效 层 析 柱 。

色 谱 峰 倾 斜

色 谱 峰 倾 斜 主 要 是 由 上 样 不 正 确 所 引 起 的 。对 于 传 统 层 析 柱 , 上 样 时 可 加 人 惰 性 有色 组 分 以 监 测 样 品 质 量 ，如 葡 聚 糖 蓝 或 重 铬 酸 钾 。如 果 样 品 在 层 析 柱 中 的 出 现 不 规 律 ，那么 在 洗 脱 图 中 将 会 出 现 不 对 称 峰 。高 效 层 析 柱 的 进 样 器 可 以 拆 卸 并 清 洗 。拖 尾 峰 一 般 因蛋 白 质 与 介 质 的 吸 附 所 致 。这 种 情 况 是 可 以 改 善 的 ，通 过 将 更 易 溶 的 盐 作 为 层 析 溶 剂 中的 主 要 离 子 组 分 ，如 高 氯 酸 钠 代 替 氯 化 钠 。在 使 用 高 效 层 析 柱 时 ，如 出 现 拖 尾 现 象 ，则 表明 二 氧 化 硅 颗 粒 的 包 被 材 料 损 耗 过 大 ，需 要 改 换 层 析 柱 。斜 峰 也 可 能 是 因 蛋 白 质 聚 合 的不 同 状 态 间 的 可 逆 平 衡 所 致 。例 如 ，血 红 蛋 白 可 以 呈 现 二 聚 体 和 四 聚 体 间 的 动 态 平 衡 。既 然 聚 合 作 用 主 要 围 绕 蛋 白 质 分 子 质 量 而 变 化 , 那 么 介 质 就 要 有 助 于 解 离 , 而 化 学 平 衡 有助 于 聚 合 。对 于 这 种 动 态 互 换 ，这 些 相 反 的 作 用 力 就 会 引 发 斜 峰 出 现 。层 析 溶 剂 的 p H 、温 度 或 化 学 组 分 的 改 变 也 可 能 使 化 学 平 衡 发 生 变 化 ，进 而 导 致 仅 一 种 多 聚 体 显 著 增 加 。

目标蛋白质消失

至少有两个原因会导致这种现象发生。第一个原因是目标蛋白质与层析柱介质适度结 合 ，洗脱峰范围较宽，导致洗脱的目标蛋白质出现于 V t 之后 ，很难将其与基线噪声区分 。若发生这种情况，应将蛋白质的增溶剂，如非离子型去污剂或适当浓度的蛋白质变性剂加入至层析溶剂。第二个原因是功能性蛋白质复合物分解为不同分子质量的离散蛋白质 ，这些离散蛋白质本身不能维持其原有功能。将不同组分混合也许有助于各组分蛋白质的络合，进而使其功能得到恢复。