材料与仪器
步骤
1.培养酵母细胞过夜，使細胞密度达到 2X108 个/ml。
2.从同一培养物中转移两份 lml 的样品至离心管中，5000 g，离心 10s 收集细胞。
3.丢弃上清，用无菌蒸馏水悬浮细胞，再离心收集细胞。
4.重悬细胞在 1 ml 的无菌 0.1mol/L 磷酸钠中。
5.用血球记数板测定细胞密度。
6.向其中一离心管中加入 30^x1EMS 并剧烈振荡分散（另一管作为未诱变的对照）。两份样品在 30°C 温育 lh，不时晃动。
7.离心收集细胞，弃上清至 EMS 废液收集瓶中。重悬细胞在 200ul 的 5% 硫代硫酸钠溶液中，转移至新的离心管中并将使用过的离心管丢弃至 EMS 废液收集瓶中。
8.用 200|ul 的 5% 硫代硫酸钠溶液洗细胞两次（废液弃至 EMS 废液收集瓶中），重悬细胞在 lml 的无菌水中。
9.细胞可以直接涂布平板，但在有些情况下让细胞在选择培养基上生长之前先生长一段时间十分重要，这样能使细胞内的野生型蛋白能够被已诱变的蛋白取代。如果菌落形成后，切记 EMS 诱变处理会导致产生一致的菌落。
>注意：此方案会使大部分二倍体菌株 40%?70% 的细胞死亡，但是对诱变剂的敏感性是随菌株不同而变化的。在诱变过程中存活的细胞相对于未诱变的对照细胞通常突变频率会增加 102~103(Lindegren et al.1965)，建议通过预实验校正 EMS 诱导的死亡率和突变频率。有一些简单的测试能够分析突变频率，也许最有效的方法就是分析 CAM 基因的功能缺失。CAM 基因功能缺失能使细胞对刀豆氨酸产生抗性（Whelan et aL 1979)，因此可将 EMS 处理后和未处理的培养物涂布在含有刀豆氨酸的平板（附录 A) 上，从而分析对刀豆氨酸抗性的细胞。另一种方法就是检测因特定基因的失活而产生抗放线酮的细胞（Kaufer et al.1983)。放线酮抗性几乎都是由于 CYH2 基因的特异性颠换造成的，但是这种突变并不是全部因为诱变（如 EMS 诱变）所造成，因此这种方法并不普及。其他常用的分析诱变的方法是基于一个或多个基因的失活导致产生突变的表型，这包括产生对 5-FOA 的抗性（URA3,URA5 或其他可能涉及渗透性的基因；Boeke et al.1986)，能在以 a-氨基乙二酸为唯一氮源的培养基上生长（LYS2 或 LYS5 基因功能缺失；Chattoo et al.1979) 以及产生红色的菌落（ADEI 或 ADE2 基因功能缺失；Jones and Fink 1982)。
2.从同一培养物中转移两份 lml 的样品至离心管中，5000 g，离心 10s 收集细胞。
3.丢弃上清，用无菌蒸馏水悬浮细胞，再离心收集细胞。
4.重悬细胞在 1 ml 的无菌 0.1mol/L 磷酸钠中。
5.用血球记数板测定细胞密度。
6.向其中一离心管中加入 30^x1EMS 并剧烈振荡分散（另一管作为未诱变的对照）。两份样品在 30°C 温育 lh，不时晃动。
7.离心收集细胞，弃上清至 EMS 废液收集瓶中。重悬细胞在 200ul 的 5% 硫代硫酸钠溶液中，转移至新的离心管中并将使用过的离心管丢弃至 EMS 废液收集瓶中。
8.用 200|ul 的 5% 硫代硫酸钠溶液洗细胞两次（废液弃至 EMS 废液收集瓶中），重悬细胞在 lml 的无菌水中。
9.细胞可以直接涂布平板，但在有些情况下让细胞在选择培养基上生长之前先生长一段时间十分重要，这样能使细胞内的野生型蛋白能够被已诱变的蛋白取代。如果菌落形成后，切记 EMS 诱变处理会导致产生一致的菌落。
>注意：此方案会使大部分二倍体菌株 40%?70% 的细胞死亡，但是对诱变剂的敏感性是随菌株不同而变化的。在诱变过程中存活的细胞相对于未诱变的对照细胞通常突变频率会增加 102~103(Lindegren et al.1965)，建议通过预实验校正 EMS 诱导的死亡率和突变频率。有一些简单的测试能够分析突变频率，也许最有效的方法就是分析 CAM 基因的功能缺失。CAM 基因功能缺失能使细胞对刀豆氨酸产生抗性（Whelan et aL 1979)，因此可将 EMS 处理后和未处理的培养物涂布在含有刀豆氨酸的平板（附录 A) 上，从而分析对刀豆氨酸抗性的细胞。另一种方法就是检测因特定基因的失活而产生抗放线酮的细胞（Kaufer et al.1983)。放线酮抗性几乎都是由于 CYH2 基因的特异性颠换造成的，但是这种突变并不是全部因为诱变（如 EMS 诱变）所造成，因此这种方法并不普及。其他常用的分析诱变的方法是基于一个或多个基因的失活导致产生突变的表型，这包括产生对 5-FOA 的抗性（URA3,URA5 或其他可能涉及渗透性的基因；Boeke et al.1986)，能在以 a-氨基乙二酸为唯一氮源的培养基上生长（LYS2 或 LYS5 基因功能缺失；Chattoo et al.1979) 以及产生红色的菌落（ADEI 或 ADE2 基因功能缺失；Jones and Fink 1982)。
来源：丁香实验
