α-卫 星 BAC 转 染 H T 1080 细胞

α-卫 星 BAC 转 染 H T 1080 细胞

材料

试剂
BAC D N A

用 QIAGEN-tip 500 柱来提取无内毒素的 BAC DNA。然后用去内毒素水重悬浮 BAC DNA至 浓 度 为 0. 5〜I.Oug/ul 。

胎 牛 血 清（F B S ; H yclone)

F u G E N E -6 (R oche)

商 品 化 的 D N A 转移系统，包括转染试剂和电穿孔装置，都 是 根 据 小 报 道 质 粒（< 5 kb) 的转染效率进行评估的。几乎没有关于 传 递 高 分 子 质 量 O l O O k b ) D N A 的效率的数据。在我们的实验中，以 小 D N A 为基础做优化的平台不一定能很好地传递大分子 B A C 。我们测试了大部分可获得的知名的商品化的转染试剂；在 我 们 的 实 验 条 件 下 ， F u G E N E -6 试剂(Roche) 在 传 递 大 分 子 D N A 方 面 最 有 效 而 且 可 直 接 使 用 ， 毒 性 小 。我 们 也 对 Lipofectamine 2000 (Invitr0 gen) 进行了实验，但是发现其方法繁琐，特别是处理多个转染时。

G 418 (50m g /m l ; Mediatech)

H T 1 0 8 0 纤 维 肉 瘤 细 胞 系

H T 1080 的培养液是含 1 0 % F B S 的 aM E M , 补 加 50ug/m l 的 庆 大 霉 素（G I B C O )。

基本培养基， Alpha (aM E M )，补 加 L -谷 氨 酸（如 Cellgro 或 G I B C 0)

曝 呤 霉 素（l 〇 m g/m l; Invitrogen )

仪器

克隆环

标准组织培养设备，包 括 I O O m m 培养皿及 T -25 烧瓶

方法

α-卫星 B A C 转染 HT1080 细胞

1 . 在转染前一天，用充足的 H T 1 0 8 0 细 胞 铺 IO O m m 组织培养皿，使第二天能够达到5 0 % 〜7 5 % 的覆盖率。每个转染的 D N A 需要至少铺两个培养皿。

2•在灭菌的 I. 5m l 离心管中加人 IOOfjJ 无血清的 c t M E M 和 4〜6ug D N A ，每个培养皿一管。在其中慢慢加人 15〜20fJ F u G E N E -6 试剂，轻弹管壁混合。仔细观察溶液中是否存在白色沉淀。如果存在，用宽孔吸头慢慢打散。

在我们的实验条件下，当 FuGENE-6 : DNA (体 积 ：质量）为 3 : 2 时 转 染 大 型 B A C 的效果最好，但是每个实验室都应该优化这个比值。需要小心的是，虽然超螺旋高分子质量的BAC 对剪切破坏力彳 I 有耐受性，但是线性高分子质量 D N A 非常敏感。

3• 室 温 下 孵 育 F u G E N E / D N A 混 合 液 3 0 〜 45m in ，其 间 轻 弹 管 壁 混 勻 。 确定没有沉淀形 成 。

4.用宽孔吸头将 F u G E N E /D N A 混合液轻轻加人 H T 1080 细胞中，持续振摇培养皿使其均匀分布。

5.37℃孵育过夜

6.第二天，吸出培养皿中的培养液，加人合适的选择培养基（如含有 3 ug/m l 嘌呤霉素或 600 ug/ml G 418 的培养基)。

G418 也被称为新霉素或 genetidn 抗生素，不 要 与 庆 大 霉 素（gentamycin) 混 淆

7.在克隆形成后，至少 挑 25〜3 0 个克隆做进一步分析。用克隆环将单个克隆转移到T -25 烧瓶中。每 3〜5d 更换新的选择培养基。形成肉眼可见的克隆需要 10〜14d。当转移单个克隆时，接种另外一个 T -25 或 T -27 板冰冻以长期储存。

用 F IS H 法鉴定 H A C 重新形成

材料

试剂
乙酸

C E P -17 cr 卫 星 探 针（Vysis) 或同等非商品化探针

Colcemid 溶 液（lOjug/m l ; K a r y o M A X , G I B C O )

乙 醇（7 0 % 、 8 0 % 和 1 0 0 % ; 储存在一 20℃

甲 酿 胺（ChemiconInternational)

H 2O , Milli-Q 处 理（特级纯）

H T 1 0 8 0 纤维肉瘤细胞，用 B A C D N A 转染，在 T-25 烧瓶中长成单克隆（见方案 1)

Hybrisol VII (Qbiogene)

KCl (0.075m ol/L )

将 5.59 g K C l 溶 解 在 I L 双 蒸 水（d d H z O ) 中形成低渗溶液。用 0.22 Mm 滤膜过滤除菌。用之前预热到3 7 ℃。

甲 醇（100%).

甲醇/乙酸溶液（3 :1 v/v)

加入 D A P I ( V ectashield， V ector 实验室）的 M ounting 培 养 液（防退色）

磷酸盐缓冲液（PBS)

20 X S S C

将 175. 3 g NaCl 和 88_ 2 g 柠檬酸钠 溶 解 在 800m l 水 中 ，用 14mol/L H C 1 调 节 p H到 7. 0。加 水 至 I L d 充分溶解高压灭菌。用前稀释。

胰 岛 素（0 . 0 5 % 溶 解 液 )

仪器

装备相差镜头的B e n c h to p型显微镜

医用离心机

Copl i n细胞培养用广口瓶

盖 片（1 号 ，各 种 大 小 ；Fisherfinest， FisherScientific)

荧 光 显 微 镜

湿 度 调 节 器

显 微 载 玻 片（Fisher Scientific 12-550-43)

Pasteur 吸 管（9in，玻 璃 ；Fisher 13-678-20D )

标准组织培养装置，包 括 15m l 圆管和T - 2 5 烧瓶

水浴，预热到3 7 °C

方法

用于染色体扩散的克隆细胞系的准备

1.当T -25烧瓶中的H T 1080克 隆（见 方 案 1 ) 细胞接近长满时，向每个烧瓶中加人I6. SfJcolcemid溶液。在 37°C 孵育40〜60 min。观察是否有圆形的分裂期细胞。

2 . 在 37°C 的水浴中预热50 ml 0.075mol/L K C 1。每个细胞株标记一个15m l 圆形管备用。

3 . 将表面细胞转移至圆形管中。用 P B S 清洗烧瓶吸去多余液体。

4 . 向每个T - 2 5 烧瓶中加入 I m l胰岛素溶液。 37°C 孵育至细胞分离。将表面细胞重新加人烧瓶中，用力吹打以悬浮细胞，将悬浮细胞转移到圆形管中。

5 . 室温下用医用离心机1500〜2000r/m in离心圆形管5〜lOmin。

6•吸去细胞沉积物上的水。在每个管中边摇晃边加入io m l 〇. 〇 75mol/L K C 1。 室温下盖上组织培养盖孵育12m in 。 按 步 骤 5 中的条件离心。在我们的实验条件下，孵育H T 1 0 8 0 的最理想时间是I 2m in 。 也可以做一些优化。

7•吸去细胞沉积物上的水。轻弹管壁重悬浮细胞以避免细胞丛生。

8.逐滴加人lm l3 : l (V/V) 的甲醇/乙酸溶液固定细胞。再另外加人4m l甲醇/乙酸达 到 5 ml。颠倒圆形管。

9.按步骤5 中的条件离心。在染色体扩散之前，可在_2〇-C 的甲醇/乙酸溶液中保存细胞沉淀物。

准备用于F IS H 的染色体扩散

众所周知，用 于 F IS H 的高质量的染色体扩散易受实验室环境因素和操作者的经验的影响。此过程的很多方面都可以更多的说是一项「艺术」，不同的实验室可能会应用不同的实验方案。下面的实验方案只是初步的框架，每个实验室可以根据自身环境做调整和优化。

在一个小密闭，且湿度可以控制的房间里进行染色体「降落」试验。比如，可以在降落步骤进行前几小时打开2〜3 个水浴和湿度调节器。

10.把固定的细胞从一 20°C中 取 出（见步骤9)。室温下用医用离心机1000〜2000r/min离 心 5〜IOmin 沉积细胞。吸去多余的固定液，轻弹管壁重悬浮细胞。

11.配置新鲜的固定液（30m l 甲醇+ I O m l 乙酸），放置到降落室中。在放满1 〇〇% 甲醇的 Coplin广口瓶中放置几个新的显微载片。

12.用 Pasteur玻璃吸管加人足够的新鲜固定液重悬浮细胞，使溶液轻微混浊，但是仍可以看清吸管。

13.擦干一个显微载片，用力吹向载片至少3 次使其潮湿；在载片的降落面形成可见的雾化状态。把载片拿到与腰齐平，玻璃吸管与肩水平。确保细胞在充分悬浮状态(一定不能成团!）在载片上滴1〜2 滴细胞悬浮液。

14.用力吹向载片表面至少3 次使其潮湿。在湿度调节器的气流上放置载片至少10s。再向降落面吹3 次保持潮湿状态。垂直晾干。如果需要可用无棉纸擦拭载片背面。不要让载片太靠近湿度调节器。只要维持其潮湿状态即可，不能形成液滴。

15.载片干燥后，用相差显微镜和 20X 目镜观察扩散状态。染色体应该是干净的，呈暗色均一状态，有很好的延展状态，但是可清晰看出是由一个细胞裂解而形成的。如果染色体的扩散状态不佳，可以尝试在固定液中直接加入乙酸再重复。或者尝试从更高高度滴落，把甲 醇 ：乙酸调整为 1 : 1，升高或者降低环境湿度。

16.向残留的细胞中加人 IOml新鲜固定液，用医用离心机1000〜200 〇 r/min 离 心 5〜l 〇 min。用之前可以在一 20°C 固定液中储存细胞。

17•把载玻片放在工作台或真空柜中过夜彻底干燥。在杂交之前，载玻片需在干燥器中储存1〜14d 。

α-卫星探针杂交染色体扩散

18•在 37°C 水浴中，把扩散干燥好的载玻片放人2X S S C 中孵育30〜90 min。

19.将预冷的7 0 % 乙 醇（在一20°C储存）装 入 Copliii广口瓶中拿到水浴前，在一2〇 °C执行如下系列乙醇洗涤使染色体扩散脱水。

a.7 0 % 乙醇洗 2 min。

b.8 0 % 乙醇洗 2 min。

c.100% 乙醇洗 2 min。

d•把载玻片从乙醇液中取出，一 次一片。用无棉纸吸干背部水分。

e. 放置在工作台上干燥lOmin。

20.72°C在 7 0 % 甲酰胺/2X S S C (P H 7.0)溶液中洗载玻片2m i n 变性样品。重复步骤1 9 的乙醇洗涤过程。将预冷的7 0 % 乙醇装人Coplin广口瓶中拿到72°C水浴前。放置在工作台上干燥I O m i n 或过夜。

21.在 20ul Hybrisol V I I 中加人0 •5/nl Vysis C E P -17探 针（或同等的非商品化探针），为每个预备杂交的载玻片准备一管。 72°C 变 性 5miri后放置在冰上。

22.将变性的探针直接加到每个载玻片上，盖上盖玻片。不要用橡皮泥或者指甲油封闭。在潮湿的盒子中孵育过夜（如放入湿的纸手帕的塑料盒；用 两 个 I O m l 吸管作为载玻片的支架)。

23.第二天，按如下步骤洗涤载玻片。在第一步洗涤中除去盖玻片。

a. 42°C在 6 5 % 甲酰胺/2X S S C (p H 7 . 0 ) 中清洗载片8 min (更高层次的cr卫星序列要进行更严格的清洗）

b•用新鲜的6 5 % 甲酰胺/2X S S C (p H 7.0)重复清洗。

c. 37°C在 2X S S C 中清洗 8m i n 。

d•用Coplin光口瓶装满Milli-Q 处理水冲洗载玻片。甩掉多余的水分，用无棉纸吸干背部水分。

24•在潮湿的载玻片上加上 20〜40ulDAPI/防脱色mounting培 养 液（Vectashield)。用P2 0 吸管头轻轻将1 号 22X 50 盖玻片放置在每个载片上。轻轻地用无棉纸吸干盖片表面多余的mounting培养基。用指甲油封闭盖片边缘。在荧光显微镜观察之前,把玻片在室温下放置在暗玻片盒里至少2 h 。 4°C 长期储存。

确 定 H A C 上的着丝粒重新形成

材料

试剂

Colcemid 溶 液（lOfxg/m l ; K a r y o M A X ， G I B C O )

之前预热到37°C 。

甲 醇 / 乙 酸 溶 液（3 : I V /V )

加 入 D A P I (V ectashield , V ector 实 验 室）的 M ounting 培 养 液

磷 酸 盐 缓 冲 液（PB S)

PBS/0. 2% T rito n X-100

— 抗（抗 C E N P-A 鼠 单 克 隆 抗 体 ；S tressg en B io tech n o lo g ies)

二 抗（如 抗 鼠 IgG /若 丹 明 或 者 突 光 素 ； Jackson Im m unoresearch)

20 X SSC

将 175. 3 g N a C l 和 88. 2 g 柠檬酸钠 溶 解 在 800m l 水 中 ，用 1 4mol/L H C 1 调 节 pH到 7.0。加 水 至 1L。充分溶解高压灭菌。用前稀释。

仪器

装 备 相 差 镜 头 的 B e n ch to p 型 显 微 镜

医 用 离 心 机

荧 光 显 微 镜

Shandon C ytospin 4 cytocentrifuge (T h erm o E lectro n )

Shandon D ouble C ytofunnels (T h erm o E lectro n 5991039)

Shandon D ouble C ytoslide，包 被 的（T h erm o E lectron 5991055)

标 准 组 织 培 养 装 置 ，包 括 15m l 圆 管 和 T - 2 5 烧 瓶
方 法

1•在 T -25 培养瓶中培养挑好的克隆细胞系。长 到 8 0 % 〜9 0 % 满后，每 瓶 加 人 25ulC o l m n i d 溶液。在 37°C 孵育大约 45m i n 。用显微镜观察圆形，分裂期细胞的产生。

2•在 C olcem id 孵育过后，把每个培养瓶中的大部分培养液转移到 15m l 圆形管中。在工作台上用力敲打 T -25 培养瓶 15〜20 次。用圆形管中的培养液冲洗新脱离的细胞，把 培 养 液（和细胞）转移回 15m l 圆形管中。

3 . 用医用离心机 200〇r/m i n 4°C 离心细胞 lO m in。 吸走培养液，轻弹管壁使细胞在残余培养液中悬浮。

4 . 边搅动边向每管细胞中逐滴加入 I m l 预 热（37°C ) 的 0.075mol/L K C l 。另外再加人4m l 预热的 0 •075m o l / L K C 1。将剩余的 0 •075m o l / L K C l 放置在冰上， 37°C 孵育细
胞 12m i n 。

5•装配标记 Shandon D ouble C y tofunnels。 用相应的为 C y to sp in 设计的包被显微载片，每片上有两个点进行细胞沉积。

6 . 室温用医用离心机 l 〇〇〇 r/m i n 离心细胞 5m i n 。轻轻倒出 0.075mol/L K C l 。用 3m l 冰上预冷的〇 • 〇 75m o l / L K C l 重悬浮细胞。.. 用转移吸管用力吹打确保全部悬浮。

7•每个 Cytofunnel 加 人 250〜300ul 细胞悬液。室温下 200r/m i n 离心 lOmin。

8 . 从 C y to s p in 上移走载片，干 燥 lO m in。 但不要完全干燥。将载片在室温下 PBS/0•2 % T rito n X-100 中孵育 6m in 。

9.用相差显微镜和20 X 目镜观察染色体扩散状态。
染色体颜色应为亮色，与背景差别较小，所以有些难于观察到。如果可以看到几个扩散,就可以断定有很多未看到的扩散存在。如果扩散很密集，用更多的〇. 〇75mol/L K C l 稀释细胞重复 Cytospin 步骤。

10.室温下用 4 % 甲醛/P B S /0. 2 % Triton X -100 固定细胞 lOmin。

11•用 P B S 清洗载片 5m i n ，立即用一抗（抗 C E N P -A 鼠单克隆抗体，用 P B S 稀释）赙育。在每个载片上盖上盖片（不要封闭）， 37°C 在潮湿的柜中解育过夜。抗体的稀释浓度可以为1/50〜1/500。

12.用 P B S 洗载片两次，每次 5m i n 。

13.每张载片加入IOOm I 用 P B S l : 200 稀 释 的 二 抗（如抗鼠 I g G 与 F I T C /T R I T C 共价结合）。盖上未封闭的盖片，在潮湿的柜中 37°C 孵 育 l h 。

14•用 P B S 洗载片两次，每次 5m i n 。

15.室温下用 4 % 甲醛/P B S /0. 2 % Triton X -100 固定样品 IOmin (见步骤 1 〇)。

16.用水洗载片两次，每次 5m i n 。

17.室温下用甲醇/乙 酸 溶 液（3 : I V A O 固 定 样 品 15m i n 。室温下在暗处干燥载片 5m i n 。

18.85°C 在 7 0 % 甲酰胺/2X S S C 中变性样品 W m i n 11

19.在一20°C 执行如下系列乙醇洗涤脱水样品。

a. 7 0 % 乙醇洗 2m i n 。

b. 8 0 % 乙醇洗 2m i n 。

c. 100% 乙醇洗 2m i n 。

d. 室温下在暗处干燥载片。

20.当步骤 1 9 中 8 0 % 乙醇脱水步骤开始时， 85°C 孵 育 F I S H 探 针 5m i n 变 性（见方案4)。使用前在 37℃储存。

21.每个细胞圈加 7〜IOul 探针，盖上22m m X 22m m 正方形盖片（不要封闭）。在 37°C潮湿的柜子中（如放人湿的纸手帕的塑料盒；用 两 个 I O m l 吸管哦作为载玻片的支架）孵育过夜。

22.42°C 用 5 0 % 甲酰胺/2X S S C 洗载片两次，每次 10m i n 。然后 42°C 在 2X S S C 洗载片IOmin0

23.擦干每张载片的背面。每张载片加 3 滴 8ul Vectashield，盖上 1 号 24X 50盖片。用指甲油封闭盖片边缘。在荧光显微镜观察之前，可 在 4°C 储存。

F IS H 探针的准备

材料

试刻
BAC D N A 模 板

用 Tris-EDTA (lOmmol/L T ris 、 lm m ol/L EDTA, pH 8. 5 ) 缓冲液准备浓度为 〇.2 ug/ul到 Iug/ul 的电泳级 BAC 载体骨架 D N A 溶液。

C O T-1 D N A (Invitrogen)

dNTP 混 合 液（〇.lmmol/L)

混合 10/J 〇.3 mmol/L dA TP、 0. 3 mmol/L dCTP 和 0. 3 mmol/L dGTP。

d T T P (0. lm m o l/L )

在 20ul 无核酸酶的水中加人IOul 0. 3mmol/L dTTP。

dU T P (0•2 mmol/L ; SpectrumGreen， SpectrumOrange，或 SpectrumRed; Vysis)

在 40ul 无核酸酶的水中加人 10M1〇 • 3 mmol/L dU TP。

乙 醇（1 0 0 % )

H 2O (无 核 酸 酶 ）

人 胎 盘 D N A (Sigma-A ldrich )

H ybrisol V II (Q bigene)

nick T ran slatio n K it (V ysis)

乙 酸 钠（3m ol/L ， p H 5.2)

仪器

琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 标 准 器 材 ，包 括 分 子 质 量 标 记

方法

标记探针

1.把一个 离 心 管 放 置 在 冰 上 冷 却 。

2 .已 下 面 列 表 的 顺 序 在 其 中 加 人 如 下 组 分 。在 加 酶 之 前 轻 微 离 心 涡 旋 。

17.5〜 x ul 无 核 酸 酶 水

X ul 提 出 的 D N A (I p g )

2.5 ul d U T P (0.2m m o l/L S pectrum G reen， S pectrum
O range 或 S pectrum R ed)

5ul d T T P (0. lm m o l/L )

IOul d N T P 混 合 液

5ul IO X n ick tran slatio n 缓 冲 液

10ul nick tran slatio n 酶

总 体 积 50ul

3.轻微离心涡旋离心管。 15°C孵育 8〜16 h 。

4•在 70°C水浴中加热 I O m i n 终止反应。冰上冷却。

随着酶量和孵育时间的延长，小的探针片段也随之增加。要想获得小的探针片段，可以应用 如 下 条 件（以片段大小逐渐减少为序）： 5ul 酶混合物+ 8 h 孵 育 ， 5ul酶混合物+ I6 h 孵育 ， IOftI 酶混合物+ 8 h 孵 育 以 及 IOul酶混合物+ 1 6 h 孵育。调整无核酸酶水的量以控制反
应 总体积在 50ul。

5•点样 10ul 用 2 % 的琼脂糖凝胶电泳检查探针的大小。大部分的探针应该在3 〇〇 bp附近。

沉淀探针

6.把 5ul(约 I O O n g 探针）的切口平移反应混合液加人离心管。加 人 1 ug C O T -1 D N A 、2ug 人胎盘 D N A 和 4ul纯水。加 入 1.2ul (0.1 体积）3m o l/L 乙 酸 钠（p H 5.2)，再加 入 30ul(2.5 体积） 100% 乙醇沉淀 D N A 。轻微涡旋在干冰上放置 15m i n 。

7.4°C ， 12 000r/min 离心 D N A 30m i n 。

8.移去上清，室温下真空干燥沉淀 10〜15m i n 。沉淀的探针可以以沉积状态储存在-20℃。

9.在 IOul Hybrisol V I I 中重悬浮沉淀。在使用之前，在 85°C 水 浴 中 加 热 5m i n 变性(见方案 3 , 步 骤 20)。重悬浮的探针可以在 4°C 储存少于 2 周或一20°C 未知时长。