体外 C re 重组酶基因 的 转 移 和 位 点 依 赖 性 重 组 的 检 测

体外 C re 重组酶基因 的 转 移 和 位 点 依 赖 性 重 组 的 检 测

材料

试剂

更 昔 洛 韦（2 mmol/L ; InvivoGen， sud-gcv)

小鼠： ZP3-C re 转 基 因 鼠（Shafietal.2000)

寡核苷酸

Cre 正 向 引 物（5’-CTGCATTACCGGTCGATGCA-3’）

Cre 反 向 引 物（5 ACGTCCACCGGCATCAACGT-3’)

质 粒 D N A : pC re 载体

这个载体含有一个修饰过的 Cre 序列，包含核定位信号和 Kozak 翻译保守元件；当电转化后需要产生 2 型等位基因结构时，可选用稍弱一些的表达载体。

方 法

体 外 C re 基因转移以建立含有 2 型等位基因的胚胎干细胞亚克隆

1.在含有 G 418 的培养液的凝胶化培养皿中培养含有 F [tkneo] 等位基因的亲代 E S 细胞 ，直到汇合度达到 7 0 % 。

2•参照方案 1 中的步骤 7〜1 3 , 准备电转化。

3•参照方案 1 中的步骤 14〜1 6 , 将 0.2〜2 ug 超螺旋形式的 Cre 表达载体与 IXIO⁷个细胞混合，电转化。

超螺旋形式减小了 Cre 载体整合进 ES 细胞基因组的可能性。用少量载体可以提高产生 2 型等位基因的频率。

4•将细胞以不同浓度（2 X I O⁴〜2 X I O ⁵个) 铺于 1 〇个凝胶化的平板，培养 3d 。

5.在开始阴性筛选之前，换用含有 2umol/L 更昔洛韦的培养液，继续培养，每 4〜5d更换一次培养液。

6.参照方案 1 步 骤 19〜24 挑选和处理克隆。

在不含 G418 和更昔洛韦的培养液中培养细胞。

7•通过 S o u t h e r n 杂交用基因组探针和 Z o x P 探针分析从复制平板中制备的 D N A 样品。

在目标载体构建过程中分别使用两个探针应该能够观察到预期的基因组片段大小 I。在基因组的探针分析实验中 2 型等位基因经常会出现与野生型等位基因类似的或相同的迁移率。loxP 探针能够区别上述两种等位基因的结构。

通过 Cre^ o i P 重组在体内进行条件性和系统性的基因诱变

在细胞培养和选择过程中，一 些 E S 细胞克隆无法形成嵌合体小鼠。虽然染色体分型和体外分化法对消除非整倍体和有缺陷的 E S 细胞克隆有很大帮助，但还是不能完全清除所有无效 E S 细胞克隆。含 有 2 型等位基因的动物对用表达 Cre 的病毒载体进行基因诱变是很有用的。