通过引入 ZoxP 转基因序列对基因组进行修饰

通过引入 ZoxP 转基因序列对基因组进行修饰

材料

试剂

电泳级琼脂糖

2X 细胞冻存液（含 4 0 % D M E M 、 4 0 % 胎牛血清、 2 0% D M S O )

50 X D enhardt 溶液

Ig 聚 蔗 糖（F ico ll， A m ersham Biosciences 17-0300-50)

I g 聚乙燔卩比咕■酮（Sigm a-A ldrich PO9 3 0 )

Ig 牛 血 清 白 蛋 白（C albiochem 126609)

溶解于 IOOml 高压灭菌的水中。

硫 酸 葡 聚 糖（1 0 % ; S ig m a-A ld rich D 7037)

二 甲 基 亚 砜（D M S O ; S ig m a-A ld rich D2650)

用于基因转移的 D N A 目的克隆：一般是 20kb 左右的同源基因组片段。

D M EM 培 养 基（G IB C O /Invitrogen 11960-044)

胚胎干细胞（E S )

学术和商业机构可以提供很多鼠 E S 细胞系，像 R l 种 系（N a g y e t a L 1993)，不需要饲养细胞，当白血病抑制因子存在时，可以直接在凝胶化的培养皿中生长。

E S 细 胞 培 养 基

500m l D M EM

1 5 % 胎 牛 血 清（94m l 储存液）

0.lm m o l/ L 非 必 需 氨 基 酸（6. 2m l 储 存 液）

lm m o l/L 丙 酮 酸 钠（6. 2m l 储 存 液）

55u m o l/L 2-巯 基 乙 醇（620/J 储 存 液）

青 霉 素 ：链 霉 素 ：谷 氨 酰 胺 的 混 合 液 比 例 为 l 〇〇 U+/ml :lO O U /m l : 2m m o l/L(6.2m l 储 存 液）

lOOOU/ml L IF (E SG R O ) (62 一 储 存 液）

乙 醇（7 0 % 和 1 0 0 % )

胎 牛 血 清（F B S ; H yclone S H 3OO7O. 〇3 )

G 418 (200m g/m l; G IB C O /Invitrogen 1 1 8 1 1 - 0 3 1 )

凝 胶（0.1%)

将 〇 .5 g 凝 胶（Type A ，从猪皮中分离；S g m a -Aldrich G 2 5 0 0 ) 溶解于 500 ml 组织培养级水中；高压灭菌。

杂交缓冲液

3 5 % 甲 酰 胺

4 X SSC

25m m o l/L N aH 2PO4

1 0 % 硫酸葡聚糖

4 X D enhardt 溶液

100m g/m l 娃 鱼 精 子 D N A

0.15 X S E T

杂交洗液

5m l 20 X SSC

I g S D S 十 二 烷 基 肌 氨 酸 钠

I L 水

白血 病 抑 制 因 子（U F ; 107U /m l) (E S G R O , C hem icon E S G 1107)

裂解缓冲液

lO um ol/L T ris-H C l (p H 7. 5)

1 0 um o l/L E D T A

10 um o l/L NaCl

0•5 % 十 二 規 基 肌 氨 酸 钠

lm g /m l 的 蛋白酶 K

M E M 非 必 需 氨 基 酸（10m m ol/L ; G IB C O /Invitrogen 11140-050)

2-巯 基 乙 醇（储 存 液 为 55m m ol/L ; G IB C O /Invitrogen 21985-023)

矿 物 油 』(Sigma- A ldrich M 8410)

N aCl-乙 醇

将 3 ml 5m ol/L 的 N aCl 溶解于 100 ml 100% 的乙醇。

N a H 2P O 4 (lm o l/L )

将 I. 7 g 二元磷酸盐（Sigma-Aldrich S9390) 和 10. 56 g —元 磷 酸 盐（J. T. Baker 4011-01)溶解于 IOOml 水中。

寡核苷酸

基因特异性引物（必须从感兴趣的目的等位基因选择）

T K 特 异 性 引 物（5 ‘-T T C G A A T T C G C C A A T G A C A A G A C G C T 0 3 ‘)

P C R 试 剂 盒（T ak ara E x T aq p olym erase; T A K A R A ， T A K R R 001)

青 霉 素 ：链 霉 素 ：谷 氨 酰 胺 的 混 合 液（比 例 为 10 OOOU/ml : 10 OOOU/ml :200m m ol/ L ) (G IB C O /Invitrogen 10378-016)

磷 酸 盐 缓 冲 液（P B S ; G IB C O /Invitrogen 14190-144)

质 粒 D N A

pfIox 载 体（Chui et al. 1997)

ploxP2 ( 用 JV 况 I 酶 切 得 到 含 Z o x P 位 点 的 探 针）（O m i et al. 1997)

用此方法也可以便利地构建其他质粒，只要酶切片段包含周围的基因组片段以及目标靶基因序列。这些质粒可用于检测同源重组前后以及 Cre 酶介导的重组后的等位基因结构。

预 杂 交 缓 冲 液

6 X SSC

20m m o l/L N a H 2P 〇 4

0.4 % SDS

5 X D enhart 溶 液

100ug/m l 鲑 鱼 精 子 D N A

蛋 白 酶 K (lm g /m l; S ig m a-A ld rich P 6556)

鲑 鱼 精 子 D N A (Sigma- A ldrich D 1626)

I X S E T

10m m o l/L T ris-H C l (p H 7. 5)

5m m o l/L E D T A

1% SDS

丙 爾 酸 钠（lOOmmol/L ; G IB C O /Invitrogen 11360-070)

20 X SSC

将 175. 3 g NaCl 和 88. 2 g 柠檬酸钠< ! > 溶解于 IL 水中，调 p H 至 7. 0。

T E 缓 冲 液

10m m o l/L T ris-H C l (p H 7. 5)

lm m o l/L E D T A

胰 酶 -E D T A ( 0 . 0 5 % ; G IB C O /Invitrogen 25300-054)

仪器

细 胞 电 击 管（Gene pulser c u v e tte ， 0.4 cm 电 极 间 隙 ；Bio-Rad 165-2088 或 同 级 别的 仪 器）

电 转 化 仪（G ene P u lser II 和 Capacitance E x te n d e r; Bio-R ad)

细 胞 计 数 器

杂 交 箱（M odel 400 H .I. ; R obbins Scientific)

细 胞 培 养 箱（37°C ， 5 % CO2)

倒 置 显 微 镜

尼 龙 膜（H ybond N + ; A m ersham R P N 303B)

P C R 仪（G eneA m p PC R System 2700, A pplied B iosystem s)

P C R 管（200jul; A p p lied B io sy stem s)

微 量 移 液 器（P 2 0 和 P 200 P ipetm an)

培 养 皿 风 口 纸（Seal P la te ; Excel scientific ST R -SEA L -P L T )

泡 沫 塑 料 盒（大 小 可 以 装 下 9 6 孔 板）

组 织 培 养 皿（凝 胶 化 的 ）

用 3 m l 明胶溶液在室温下凝胶化培养皿（10 cm, NUNCLON A Surface; NUNC 172958)

l h ，弃掉多余的溶液。

组 织 培 养 板（9 6 孔 ，平 底 ，凝 胶 化 ）

5 〇 ul 明胶溶液凝胶化 I h , 吸出多余的溶液。

组 织 培 养 板（96 孔 ， U 形 底 ）（ N U N C L O N A S urface; N U N C 163320)

37°C 和 55°C 水 浴

X 射 线 片（BioM ax M S ; K odak 8294985)

方 法

制备和鉴定 DNA

可以扩展 F 目的载体的边界构建一个对照载体，从而使检测重组所用
P C R 引物被包括在内。

1.用合适的限制酶内切核酸酶消化的基因组/转基因克隆，得到我们感兴趣的 D N A片段。

2•将 D N A 片段插入 pflox 载体的限制酶酶切位点，如果需要还可以采用平末端连接。

XteI 和（或）S a H 用于短臂的插人， JSaOTffl 用于中等长度臂的插人， HindIII 和（或）XZwI 用于长臂的插人（图 2A )。

3.用合适的限制性内切核酸酶（如 No i l) 切割载体成线性。

4•琼脂糖电泳鉴定质粒的浓度和质量。

5•将分离的线性载体储存在无核酸酶的 T E 缓冲液中。

胚胎干细胞的培养和电转化介导的基因转移

6•在凝胶化的组织培养皿上复苏并培养 R l 或类似的胚胎干细胞。
每天更换培养液直到汇合度达到70%。

7.在电转化前 4 h 更换培养液。

8•用 P B S 洗细胞，加 人 I m l 胰酶-E D T A , 37°C 孵 育 5m i n 。

9.轻轻振荡使细胞从培养皿上脱落；加 人 9m l 培养液，轻轻吹打细胞，吹散细胞团，使细胞重悬。

10•细胞悬液转人一个 50m l 的离心管， 190 g 离 心 5m i n 。

11•吸出上清，将细胞重悬于 30m l 灭菌的冷 P B S 中。

12.用细胞计数器计算细胞的数量。

13.190g离 心 5m i n ; 吸出上清，将细胞重悬于灭菌的冷 P B S 中使细胞浓度达到每80 〇 ul悬 液 中 含 IO⁹ 个 细 胞 。

14.将细胞悬液转人一个灭菌的细胞电击管中，与 I0ug 线性的载体混合；冰 浴 1 〇 min。

15_将电转化仪设置到如下参数：电 压 240V ，电 容 500uF 。将细胞电击管的电极面向连接器放置，传送电脉冲。

1 6 . 将细胞电击管放在冰上孵育 l O m i n。

17•将细胞稀释成不同浓度（每个培养皿〇.5X 10⁶〜2X 10⁶ 个细胞），培 养 24 h 。

18.为了进行阳性筛选，换成含 200ul/ml G418 的培养液进行培养。
1〜2d 更换一次培养液，直到 CU18 抗 性 克 隆 长 到 2mm左 右 ， 一 般需要 7〜10 d。

19•准备凝胶化的平底 96 孔板，向每孔加人 150ul 含 G 418 的培养液；准备每孔含胰酶- E D T A 的 U 形 底 96 孔板。

2 0 . 将含有克隆的培养皿中的培养液换成 P B S ; 将培养皿置于倒置显微镜下。

21.将 20ul 的移液器设置为 10ul，吸取一个 G 418 抗性的克隆，转移到含胰酶的 9 6 孔板中。

2 2 . 为另外的培养、冻存及制备 D N A 准备细胞。

为了避免冻存细胞的步骤， PCR 检测必须用很少的细胞完成，还必须在原始平板（masterplate) 中细胞融合前完成。

在原始平板中冻存细胞的步骤

a•用 200ul移液器在约 80ul 胰酶-E D T A 溶液中轻轻重悬细胞；将 50ul的细胞悬液转到一个 96 孔 板 中 [用于细胞培养和（或） 冰冻的原始平板]; 将剩余的约30ul 含胰酶-E D T A 的细胞悬液转入凝胶化的平底 96 孔 板 中（用于制备 D N A 的复制平板，见后面） ，并加人 150ul培养液；将原始平板和复制平板都放回培养箱中。

b•在含 G 418 的培养液中培养细胞 3〜5d 。

这时原始平板中的大部分克隆可以冻存；继续培养复制平板中的细胞直到可以得到最髙的DNA 产量，作 为 PC R 的模板。

c•用灭菌 P B S 洗孔 2 次。

d•加人 5 〇 M 胰酶——E D T A ， 37°C 孵育 5m i n 。

e.加人 50ul 冰冷的 2X 冻存液，用移液器轻轻吹打以 重 悬 细 胞 。

f•加人 100ul 冰冷的矿物油。

g. 用封口膜封住 96 孔板，放人泡沫箱中，移入一 8 〇°C 冰箱。

从 复 制 平 板 中 制 备 D N A 的步骤

a•用 P B S 洗复制平板，加 人 50ul 的裂解缓冲液。

b•密封平板， 55°C 孵 育 2〜3 h 。

c. 加入 15 〇 4 N a C l-乙醇溶液；室温孵育 30m i n 。

d. 慢慢倾斜平板以倒出上清，或离心平板后轻轻吸出上清。

e•用 200ul 7 0 % 的乙醇洗孔 3 次 ，在实验台上干燥 D N A 。

f•向每孔加人 30ul T E 缓冲液，密封平板， 3 7 ℃ 孵育过夜。

不冻存原始平板细胞，直 接 通 过 P C R 筛选的步骤

当对照载体 P C R 检测的灵敏度足够高时，再检测目的克隆。

a. 用 200ul 的移液器轻轻吹打含有胰酶—— E D T A 的复制平板中的细胞。

b . 将细胞悬液转人一个无菌的 15m l 锥形离心管中，离心管中至少含有 5m l 的细胞培养液。

c•离心使细胞沉淀，吸出培养液。

d. 用 500ul P B S 洗细胞，将细胞转人一个 1.5m l 离心管，离心使细胞沉淀；吸出 P B S 。

e. 将细胞重悬于 200ul 高压过的双蒸水中，并马上放在干冰上。

f. 煮沸 5m i n ，短暂离心以去除管壁上的水滴。

g. 加 入 50jul 蛋白酶 K ， 55°C 孵育至少 5 h (或孵育过夜） 。

h . 煮 沸 5m i n 以使蛋白酶 K 失活。

23.将 2 〇ul 用 于 PCR 检测。

24.培养 PC R 阳性克隆，使细胞增殖。

25.通过基因组 S o u t h e r n 杂交分析克隆的 Z o r P 位点。

对于 ZorP 的基因组 Southern 杂交分析，选取一个或多个不包含于质粒 DNA 序列中的探针，同时选用 ZorJ3 探针 （如分离的 JNtoI 酶切片段； 见图 2D) 进行基因转染，以探测所有的 Z mtJd 位点的存在。作为替代方法也可以选择能够区别于等位基因片段的基因载体的限制酶酶切片段