阳离子多糖的合成及体外转染

阳离子多糖的合成及体外转染

材料

试剂

联辛可宁酸（B C A ) 试 剂 盒（Pierce)

(3 -gal ELISA 试 剂 盒（Roche) 或 (3 -gal 检测试剂盒（Invitrogen)

磷酸钙试剂（S i g m a-Aldrich)

待 转 染 细 胞 ，如

C 3 H 10T 1/2

H E K 293

C H O

H eL a

N IH 3T 3

EPC

COS-7

葡 聚 糖（平 均 分 子 质 量 40kD a) (Sigma-A ldrich )

胎 牛 血 清（FBS) (Beit Haemek, Israel)

谷 氨 酷 胺（4nm ol/L ) (B eit H aem ek ， Israel)

HEPES■缓冲生理盐水（HBS; 150 mmol/L NaCl， 20nmol/L HEPES， pH7.1)

用0.2um膜过滤除菌或高压灭菌于 4°C 保 存 。

人生长激素（hGH) ELISA 试 剂 盒（Roche)

盐酸羟胺

磷脂配方

D O T A P /C h o l 1/1 (A vanti P o lar Lipids Inc. , A labam a)

T ra n sfa st (P rom ega)

F u G E N E 6 (R oche)

萤光素酶报道基因检测试剂（R o c h e) 或萤光素酶检测试剂盒（P r o m e g a )

培养基

完全培养基： DMEM，含 10% (m/m) 胎 牛 血 清（FBS)、 0.2 mmoI/L L -谷氨酰胺、 lmg/m l 青霉素， IOOUAnl 链霉素
D M E M (D ulbecco’s m odified E agle’s m edium )

氮 气（储存复合物用）

青 霉 素（Beit H aem ek ， Israel)

质 粒

pEGFP-C l, C M V 启 动 子 ；pLN Cluc 质 粒 ，含 萤 火 虫 萤 光 素 酶 基 因 ；pLacZ, SV4 0 或CM V 启动子；pCM VhGH 用 于 定 量 及定性分析。使 用 Nucleobond AX 500 柱（Machery-Nagel， Duren， Germany) 或 QIAGEN Plasmid Mega Kit (Hilden， Gerimany) 纯 化 质 粒 。D N A 的浓度通过磷的含量确定，磷含量代表了 D N A 负 电 荷 的 量。

高 碘 酸 钾（K I O 4) (Sigma-Aldrich)

硼 氢 化 钠（N a B H 4) (S i gma-Aldrich)

精 胺（S i gma-Aldrich)

链 霉 素（Beit H a e m e k ， Israel)

仪器

纤维素透析管（截留分子质量 3500)

6 孔细胞培养板

D o w e x - I (醋酸盐型）阳离子交换树脂

突光显微镜（M o d e l Axiovert 35， Zeiss, Jena, G e r m a n y )

冻干机

分光光度计， N M R (核磁共振波谱仪），红外

方法

阳离子多糖的合成：葡聚糖的氧化

1•将葡聚糖（l 〇 g ， 62.5m m 〇 l 糖单元）溶 于 200m l 二次去离子水中。

2.以 I : 1 的摩尔 比（糖单元/IO_4-) 加入高碘酸钾，室温下避光搅拌 6〜8 h 。

3 . 通 过 D owex- 1 离子交换柱除去 I O r 及未反应的 I O r ， 纯化聚醛。再用二次去离子水4°C 透 析（纤维素透析管，截留分子质量 3500) 3d 。

4 . 冻干纯化后的聚醛衍生物。产物为白色粉末。

平均产率为 7 0 % 。 FT-IR (KBr) 在 1724 cm-1 观察到 C= O 吸收峰。

5.通过羟氨盐酸盐滴定测定聚醛含量（Z h a o and Heindel 1991)。
寡胺键合

6•将氧化后的葡聚糖（l g ， 0.75〜6. 56m m o l 醛基）溶 于 I O O m l 二次去离子水中。将其缓慢滴加到 50m l 含 有 5 0 % 过量精胺的硼酸盐缓冲溶液中。

7 . 室温下搅拌 2 4 h 。 加 人 N a B H 4 (l g ， 4 倍醛基摩尔数），将亚胺还原成 胺 。 继续搅拌 48 h 。

8•另用 N a B H 4 (l g ， 4 倍醛基摩尔数），反 应 24 h , 重复还原。

9•将亮黄色溶液转移到透析管中（纤维素透析管，截留分子质量 3500)，用二次去离子水 4°C 透 析 3d 。

1 〇•冻干透析产物，氮气条件下储存。平均产率为 5 0% (OT/m )。通过对产物的核磁共振分析得到产物的氨基比例。（m ) 多重峰，（H ) 质子氢。

细胞数除以视野内的总细胞数计算转染效率（转染百分比)。
在有些情况下，基因表达可以用标准 BCA 试剂盒检测蛋白总量，对结果归一化