重组小 RN A 病毒基因组导人细胞

重组小 RN A 病毒基因组导人细胞

材料

试剂

琼 脂 糖

小 牛 血 清

二 乙 氨 乙 基 葡 聚 糖（D E A E -dextran)(0.5m g/m l; M r= 500 000; Sigma-A ld H c h )

消过毒的 Falcontube 中加人 20m g 二乙氨乙基葡聚糖， 40mlHBSS。剧 烈 振 荡 5 min。可以在 4℃ 保 存 1 个 月 。

D N a s e (不含 R N a s e , R o c h e 10776785001)

D M E M (不 含 血 清 ， Invitrogen 11965-092)

不同的细胞类型可能需要其他的培养基。

乙 醇 [ 7 0 % (V /V ) 和 1 0 0 % ]

H ank 平 衡 盐 溶 液（H B S S ; Invitrogen 14025-092)

H e L a R 1 9 细 胞（对 数 生 长 期）

H 2O (超 纯 水）

使用超纯水和 RN A 实验专用的化学药品就不用再对溶液进行髙压灭菌或者 DEPC (焦炭酸二乙酯）处 理 。

体 外 T 7R N A 聚 合 酶 试 剂 盒（ Stratagene 600124，或 者 相 似 的 试 剂）

苯 酚 ：氯 仿 [50 : 50 (V /V ]

质 粒

构建质粒应该将重组病毒或者表达所需基因的复制基因组插人到一个 T7 RNA 聚合酶的启动子后面。

适 当 的 限 制 性 内 切 核 酸 酶 ，用 于 质 粒 的 线 性 化

T A E 缓 冲 液

40m m ol/L T r is

lmmol/L EDTA

20 mmol/L 乙酸

仪器

CentriSpin 20 columns (Princeton Separations， CS——2 〇 l 或者类似物）

E P 管

冰 箱一 80℃

培 养 箱（37°C ， CO2)

离心机

摇床

细胞培养皿（直 径 35m m )

方法

重组 R N A 的转录

一 个 50ul的转录反应应该可以产生 5〜20ug 的 R N A ，足够用于转染几个 35m m平皿。大概每一个 35m m 平皿的用量为 2ug R N A 。如果需要转染更多的平皿，可以相应地增加转录反应量。

1.线性化 1〜2ug 包含有目的基因的病毒或复制子的质粒。

2.使用商业化的 T 7 R N A 聚合酶试剂盒在体外对线性模板进行转录，最终反应容量为50ul，可参阅产品说明。

转录完成后，可 以 加 人 1 0 单 位 的 DNase (不 含 RNase) 37℃温 育 15m in 去 除 模 板 DNA,此步可省略。

3•确定 R N A 浓度。

4•在 C entriSpin 20 c o lu m n 中提纯 R N A (或者相似的去盐离心柱），可参阅产品说明。

另外，还 可 以用苯酚：氣仿抽提，然后用乙醇洗涤。如 果 RNA 转录产物的浓度已经足够髙 （＞2 0 0 ng / ml ) , RNA 提纯就可以省略。

5•使用 T A E 缓冲液，进 行 1 % 琼脂糖凝胶电泳，估 计 R N A 的质量和完整性。

6.立即使用 R N A 进行转染或者在一 80°C 下冷藏待用。

R N A 转染细胞

7.R N A 转染前 24 h , 将处于对数生长期的 H e L a R 19 细胞接种于 3 5mm平皿。

转染时，细胞应该达到 50%〜70% 的汇合度。

8•对于每一个将要进行转染的平皿，混合 2F 1 体外转录 R N A (步骤 6 中获得）和 300ul二乙氨乙基葡聚糖（D E A E -dextran)。冰上孵育 30m i n 。
每 300ul 的 DEAE-dextran 加 入 RN A 不 应 超 过 10ul，如果体外转录后， RNA 浓度已经高于ZOOng/ul, 可以直接加人而不用提纯，即可省略步骤 4 。

9 . 转染前，用 冷 H B S S 洗 H e L a 单层细胞两次。

1 0 . 从平皿中吸出 H B S S , 在每个平皿中加人 300ulDEAE-dextran/RNA 混合物。放在摇床上，室温振荡 30m i n 。

需 要 加 入 一 个 对 照 平 皿 ，即 没 有 加 R N A ，其 他 操 作 相 同 。实 验 中 要 确 保 细 胞 不 干 。

11.每个平皿中加人 2m l 预热的 D M E M (不含血清）。 37°C 含 CO2 保温箱培养 lh 。

1 2•吸出培养基，加人预热的 D M E M (含 2 % 小牛血清）。 再次放人 37°C 含 CO2 保温箱培养。

13.定期检査平皿细胞病变效应（C P E ) 或检测插入基因的表达情况 （复制子或重组病毒)。

亚 基 因 组 P V 复 制 子 的 蛋 白 质 表 达 最 多 经 历 6〜 12 h 的 后 转 染 。 因 为 没 有 合 成 具 有 侵 染 性 的病 毒 颗 粒 ，也 不 会 转 染 其 他 的 细 胞 。随 着 转 染 细 胞 的 死 亡 ，表 达 也 迅 速 的 减 少 。病 毒 构 建物 转 染 的 细 胞 在 后 转 染 的 前 几 个 小 时 表 现 相 似 。但 是 ，有 感 染 性 的 颗 粒 增 殖 、传 播 ，杀 死平 皿 中 的 所 有 细 胞 。对 于 野 生 型 的 P V R N A , 在 后 感 染 24 h 内 就 可 以 观 察 到 完 整 的 C P E 。以 病 毒 为 基 础 的 表 达 载 体 经 常 会 有 标 志 性 的 延 时 C P E ( 直 到 4d 后 ) 。一 般 来 说 ， C P E 出 现比 野 生 型 病 毒 延 时 的 时 间 代 表 了 构 建 物 合 适 度 和 遗 传 稳 定 性 的 降 低 。

14.反复冻融平皿 3 次，使得病毒从细胞中释放出来。

15.将所得液体转入 E P 管中， 14 OOOr/m i n 离 心 l m i n 。

16.含有病毒的上清液一 80°C 保存。

病 毒 可 以 通 过 一 次 和 二 次 传 代 进 行 扩 增 。但 是 因 为 大 多 数 病 毒 构 建 物 的 不 稳 定 性 ，在 后 继的 实 验 中 ，最 好 使 用 最 早 的 传 代 病 毒 ，并 且 经 常 通 过 R N A 转 染 得 到 新 的 病 毒 ，而 不 是 传代 得 到 新 病 毒 。使 用 寡 核 苷 酸 引 物 利 用 反 转 录 P C R 技 术 扩 增 插 人 片 段 ，可 以 监 测 病 毒 构 建物 的 稳 定 性 。