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从骨髓和白血病血液样品中提取染色体

相关实验：收获分裂中期的细胞对恶性肿瘤患者的血液标本进行细胞遗传学分析实验

最新修订时间：

材料与仪器

骨髓或血液样本
HBSS KCl 溶液 甲醇 冰乙酸
组织培养瓶 培养管 台式离心机 5% CO2 培养箱 离心管 烤箱 巴斯德吸管 洁净的载玻片 相差显微镜

步骤

南 1. 在层流通风橱中将两个50m l 细胞培养瓶标注以下信息：患者序列号、患者姓名、曰 期、实验开始时间、 A 或 B 培养基。 2 . 向标注A 的培养瓶中加人IO m l完全培养基A ，向另外一个瓶中加入IO m l完全培养 基 B。如果样品量不足可以只选择一种培养基。 3. 用网垫去除注射器或试管的盖子，将样品转移到经过灭菌处理的15m l 培养瓶中。如 果是运输来的样品在培养基中会含有肝素锂，存放在紫色盖子的试管中含有E D TA ， 需要用I O m l 骨髓培养基洗两次，每次室温下250g 离 心 l O m i n 。 4 . 向每个培养瓶中加入0. 6〜0. 8m l 骨髓或者I.O m l 白血病患者的血液，拧松瓶盖，涡 旋混匀。如果白细胞计数超过100 O O O 个细胞，只加入0.1〜0.2m l 骨髓，如果白细 胞计数少于1000个细胞则需加入0. 9m l 骨髓。 5. 37°C 培养15〜24h 。将培养物转移到15m l 离心管中。每管加人IOOjLil含 500m g /m l 溴 化乙锭的H B S S ，轻柔混匀。 37°C 静 置 1〜2h 。每管加入 lOOju l l O m g/m l 秋水仙酰 胺 ，轻柔混匀。 37°C 静置培养20〜45m i n 。 6. 室温下250g•离心l O m i n。弃上清。轻轻拍打管壁或轻柔涡旋以重悬沉淀，要确保管 底没有残余沉淀。 7 . 向每管轻轻地逐滴加入I O m l 预热的0.075m o l / L K C l 溶液，盖上盖子，缓慢地来回 颠倒使其充分混勻。 37°C 静 置 15〜20m i n 。 8. 每管逐滴加入I m l 体积比为3 : 1 混合的甲醇、冰乙酸固定液。盖上盖子，缓慢颠倒 混勻。室 温 下 250g 离 心 l O m i n 。弃上清，重悬沉淀。缓 慢 加 人 I O m l 的 3 : 1 甲 醇/冰乙酸固定液。盖上盖子，室温下静置超过l O m i n。 9. 室温下250g 离 心 l O m i n 。.弃上清并重悬沉淀。缓慢地逐滴加入3 : 1 甲醇/冰乙酸固 定液。盖上盖子缓慢颠倒混匀。再重复两次。将已固定的细胞置于4°C 保存。 IOa•对于S T A T 病例：保存过夜后，对玻片进行预处理，将玻片置于阳〜阳^烤箱 中加热1.5〜2h 或置于微波炉中加热& 5〜4.5min。玻片充分冷却后，进行吉姆 萨胰 蛋 白酶显带（ 单 兀 4 . 3)，将胰蛋白酶消化的时间缩短约i〇 s 以保持玻片的 新鲜。 IOb. 对于其他病例：室 温 下 静 置i 5min 。室 温 下 邠 吆 离 心 1〇 m in。弃上清。每管以 〇.5〜3m l 新 鲜 3 : 1 甲醇/冰乙酸固定液重悬。加入足够地固定液使得悬液呈蒲 雾状。 l i b . 将少量悬液吸入巴斯德吸管中。悬液不得超过吸管中段， 因 为超出的部分不易被 打出。从 12.7 (5in) 〜61cm (2ft) 向清洁的载玻片中滴下4 或 5 滴悬液。 由 于 实 验 室 的 环 境 在 温 度 和 湿 度 上 各 不 相 同 所 以 最 好 试 用 多 种 方 法 以 确 定 什 么 样 的 玻 片 比 权 好 ：是 湿 的 或 干 燥 的 ，是 预 冷 的 或 是 室 温 的 。 K b •检查玻片的数目，_ 用相差显微镜检查染色体的分散度。如果分散度不够则可参 表 10.1.2 (或单元4, 1 ) 中所介绍的方法进行调节。 制 作 4 张玻片，每种培养^ 张。在 85〜95°C 烤箱中烘干玻片。

4 瓶 ：两瓶分别以完全培养基A 和 B 培 养 24h，不诱导；两瓶分别以完全培养基 A 和 B 培 养 3d，以 PWM进行诱导。 ， 2. 向准备进行3d诱导培养的培养瓶中加入PWM, 用量为0. 3ml/10m l完 全 培 养 基 （ A 或 B)，轻轻混匀，拧紧瓶盖。 4 瓶均置于37°C进行培养。 3. 收 获 细 胞 （3d 培养的培养物省略溴化乙锭处理的过程） ，按照前述方法固定、制备 分散染色体标本（ 基本方案，第 5〜12步)。 备选方案2 以多发性骨髓瘤患者的骨髓和外周血样品制备分散的 染色体标本 附加 材 料 （ 基本方案） 含 ljug/500/J 白细胞介素 4 (IL-4， Sigma) 的 R P M I (Life Technologies; Irving Scientific)，分装为 IOOilJ/管置于一2(TC保存。 1. 按上述方法进行骨髓和外周血的培养（ 基本方案，第 1〜4 步） ，如下所述共培养3 瓶 ：两瓶分别以完全培养基A 和 B 培 养 24h ，不诱导；一瓶分别以完全培养基A 或 B 培 养 5d ，以 IL-4 进行诱导。 2 . 向进行5d 培养的瓶中加人10(^n L -4 i n R P M I ，轻柔混匀，拧紧瓶盖。 3 瓶均置于 37°C 进行培养。 3 . 收 获 细 胞 （3d 培养的培养物省略etHdmmbromule处理的过程） ，按照前述方法固 定 、制备分散染色体标本（ 基本方案，第 5〜12步)。 备选方案3 以淋巴结样品制备分散染色体标本 附 加 材 料 （ 基本方案；标八的条目参见附录1) 淋巴结样品 骨髓培养基（ 如 Life Technologies, Sigma) V 胶原酶溶液 ， 5mlpetri 皿 ， 60m m X 15m m (Falcon) 小刀 I. 在 5m l petri皿上标明以下信息：序列号、患者姓名、实验开始日期和时间。 2•用小刀或吸管将淋巴结标本移入标记好的petn皿中。切碎标本直至没有大块残余。 加人少量骨髓培养基以保持样品湿润。 3 . 向皿中加人以下试剂： 4. O m l 骨髓培养基； Iml胶原酶溶液； 8m l 秋水仙素。 轻柔混匀， 37°C培 养 15〜24h。 4 . 将样品转移到离心管中，按前述步骤收获细胞、固定、制备分散的染色体标本（ 基 本方案，第 6〜12步） 。
备选方案4 以脾组织样品制备分散的染色体样本 附 加 材 料 （ 基 本 方 案 ；标_7 的 条 目 参 见 附 录 1) 脾组织样品 V 胶原酶溶液 5ml petri 皿 60mmX 15mm (Falcon) 小刀 1. 在 5ml petri皿上标明以下信息：序列号、患者姓名。用小刀或吸管将淋巴结标本 ( < 3 m m ) 移入标记好的petnUIL中。跺碎或切碎标本直至没有大块残余。如果仍有 块状物残留则加入0. 5m l 胶原酶溶液。 2 . 在两个50ml组织培养瓶上表明以下信息：患者序列号、患者姓名、日期、实验开始 时间和A 或 B 以标志是使用的哪种培养基。向相应的培养瓶中加入IOml完全培养 基 A 和 B 。 3. 将样品的一半分别转移到培养瓶中37°C 培 养 15〜24h 。将培养物转移到离心管中离 心收获细胞，固定、制备分散的染色体标本（ 基本方案，第 6〜12步)。

来源：丁香实验

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