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    用 MHC-I g 二 聚 体 检 测 抗 原 特 异 性 T 细胞

    相关实验：免疫分子与受体工程学

    最新修订时间：

    材料与仪器

    步骤

     

    基 本 方 案 构 建 MHC I-Ig 二聚体

    材 料

    编码目的 M H C I 类分子的 c D N A 及合适的引物

    M Z w I 和 X k I 限制性内切核酸酶及缓冲液（N e w England Biolabs)

    T A 克 隆 试 剂 盒（Invitrogen)，可选

    p X I g 质 粒（可向作者索取）

    10X T 4 D N A 连接酶缓冲液，添 加 5m m o l / L A T P

    I Weiss 单位/M1 的 T 4 D N A 连 接 酶（Life Technologies)

    L B 平 板 ，含 50M g/m l 氨苄青霉素和 30M g/m l 卡那霉素

    L B 培养基，含 50jutg/m l 氨节青霉素

    PvuI 限制性内切核酸酶及缓冲液

    含有人类基因组 P2 微球蛋白基因的质粒（可向作者索取）

    3m o l / L 乙酸钠， p H 5. 2

    1 0 0 % 乙醇

    J558L 细 胞（可向作者索取）

    x/R P M I -10 完全培养基，含 l O m m o l / L H E P E S (完全 R P M I -10/H E P E S )

    10m g / m l G 418 (Life Technologies)

    14°C 水浴

    微量离心机， 4°C

    25c m 2 培养瓶

    Bio-Rad Gene Pulsei•(或与其相当的电穿孔仪）及用于真核细胞0.4cm间隙的电
    图 1 5 . 1 . 1 二 价 的 MHC-IgG嵌 合 分 子 的 构 建 及 其 构 型 。 A.pXIg质 粒 示 意 图 ， MHC I 类 分 子 胞 外 区 的 编 码 序 列 处 于 Ig G l基 因 重 链 可 变 区 之 中 。 B. 用 来 向 鼠 H-2Kb cDNA分 子 引 人 适 当 的 限 制 性 内 切 核 酸 酶 位 点 I 和 XAoI) 的 核 苷 酸 序 列 。 C.H-2Kb/IgG分 子 结 构 模 型 示 意 图 。 1 . 用 IOOjuI反应体积， P C R 扩增编码目的M H C I 类分子的 c D N A 并引入所需的限制性 内切核酸酶位点。用 含 有 位 点 的 5'引物和含有XZioI位 点 的 Y 引物，并使其与
    M H C 分 子 W 结构域末端的可读框架对应（如 图 15. 1.1)。 2 . 取 IOiUl反应产物进行琼脂糖凝胶电泳以检测P C R 扩 增 是 否 成 功 （C P I 单 元 10. 4)。 3 . 用酚/氯仿抽提、乙醇沉淀来纯化扩增的M H C I 片段。 4 . 用 和 X k I (C P I 单 元 10. 8 ) 酶 切 P C R 扩增所得的 M H C I 基 因 ，进行琼脂糖 凝胶电泳，用电洗脱法从胶上分离所需要的片段（C P I 单 元 10.5)。或 者 ，用 T A 克 隆试剂盒直接克隆P C R 产物并对插入片段测序。 5 . 用 M ^ I 和 X k I 酶 切 pXIg质粒并按照步骤4 纯 化 10〜12k b 大小的载体片段。将酶 切并且纯化好的P C R 片段及pXIg载体片段进行琼脂糖凝胶电泳以进行D N A 定量。 6 . 用纯化的片段设置如下连接反应（插入片段/载体片段的摩尔比为1 0 : 1 ) ，用水将总 体积补至 l〇M l， 14°C 水浴过夜。 50ng p X I g 载体片段 50ng M H C 片段 Ipd 10X T 4D N A 连 接 缓 冲 液 （含 5m m o l / L A T P ) 1/xl 1U /M1 T 4D N A 连接酶。 7 . 用电 穿 孔 法 转 化 感 受 态 细 胞 （C P I 单 元 10. 15)， 50/^1感受态细胞用1〜2W 连 接产物。将转化的细菌涂布于含有50/xg/m l 氨 苄 青 霉 素 和 30M g/m l 卡 那 霉 素 的 L B 平板 ， 37°C 孵育过夜。 8 . 从平板上挑取克隆，将单一克隆转移至5m l 含 有 50M g/m l 氨 苄 青 霉 素 的 L B 培养基 中， 37°C 振摇培养过夜。用碱裂解法提取质粒D N A (小量制备， C P I 单 元 10. 3)。 9 . 用限制酶作图来筛选所需的插入片段存在与否，如 果 还 没 有 进 行 过 测 序 （步 骤 4)， 则对含有插入片段的克隆进行测序验证。 1 0 . 大量培养测序正确的克隆并用碱裂解法提取D N A (大量制备， C P I 单 元 10. 3 ) 。 11• 用 限 制 性 内 切 核 酸 酶 将 融 合 质 粒 D N A 线 性 化 （如 M H C 片 段 含 有 P p u I 位点 则换用别的酶）。同样用P x m I 限制性内切核酸酶将含有人^微球蛋白基因组序列的 质粒线性化。用琼脂糖凝胶电泳验证酶切完全与否（如(32微球蛋白应产生两条带）。 12. 用酚/氯仿抽提 D N A ，然后进行乙醇沉淀，用 0. 1 体 积 的 p H 5.2、 3m o l/L 乙酸钠 缓冲液及2 体 积 1 0 0 % 的乙醇。一20°C 培 养 30m i n 。 4°C ，最高速度微量离心D N A 。 用无菌的去离子水重悬D N A ，使其浓度为 l m g /m l 。 13. 用溴化乙锭斑点法对D N A 进 行 定 量 （C P I 单 元 10. 5)。 14•培养J558L 细胞至密度为I.O X l O 6个细胞/m l ，计 数 细 胞 （附 录 3A ，每份转染需要 7. 6 X 106个细胞）。 1 5 . 向一个25c m 2的培养瓶中加入7. 2ml R P M I -10/H E P E S 完全培养基并保温至37°C ， 并将电转杯置于冰上。 16•用R P M I -10/ H E P E S 完 全 培 养 基 洗 涤 细 胞 一 次 。 4°C ， 3Q Q g 离 心 5m i n ，弃 上 清 。 用 R P M I -10/ H E P E S 完全培养基重悬细胞，使 其 浓 度 为 I X l O 7个细胞/m l ，吸取 760jul至电转杯中。 17•将4M g 线性化的 M H C -I g 质 粒 D N A 及 40M g 线性化的p2微球蛋白基因组D N A 加到 细胞悬液中，在冰上孵育l〇m i n 。 18•用Bio-Rad Gene Pulser以如下参数进行电穿孔： 9 6 0 @ 和 0. 35k V (时间常数为
    18〜22m s )。将细胞放回冰上并孵育lOmin。 19.将 细 胞 转 入 25c m 2的 含 有 预温培养基的培养瓶中。不 加 筛 选 药 物 ，于 37°C 孵育 过夜。 20•用台盼蓝拒染法测定细胞的活力（附 录 3C )。预期活力为1 0 % 〜5 0 % (活力> 5 0 % 可能提示电穿孔效率较低）。 21. 将细胞在 4°C ， 500g 离心 lOmin。用含有 l m g / m l G 418 的 R P M I -10/ H E P E S 完全 培养基重悬细胞。将细胞稀释后接种于％孔平底板中，使每 一 孔 中 含 有 约 0.3个 对 G 418有 抗 性 的 细 胞 （假 定 1000个活细胞中仅有1 个细胞能产生对 G 418有抗性 的克隆）。 37°C 将细胞孵育2 周 ，使细胞扩增至汇合生长。 22. 用 E L I S A 法 （见 辅 助 方 案 1 ) 检 测 细 胞 克 隆 分 泌 I g 样 分 子 的 情 况 ，将阳性克隆 扩增。 辅 助 方 案 1 测 定 MHC-Ig 融合蛋白浓度 有两种方法用于测定M H O I g 融合蛋白的浓度。根 据 包 被 E L I S A 板所用的一抗类 型 不 同 （羊 抗 鼠 IgGl F c 片段或抗鼠M H C 单克隆抗体），其对应的 E L I S A 所测定的分 别 是 I g 样蛋白的浓度和M H C - I g 嵌合蛋白的浓度。 材料 抗体： 羊抗鼠 IgGl (Southern Biotech) 抗鼠1\««： 1类 分 子 单 克 隆 抗 体 （111八 1))，《：链 （如 387.2、界6-32、 30.5.73、 20.8.4； A T C O 碳酸盐缓冲液： 5.26g/L 无水碳酸钠， p H 10.4 (用盐酸调节） 封闭缓冲液： 1 % (V /V ) F B S ，用碳酸盐缓冲液配制 洗涤缓冲液：P B S (附录 1)，含 1 % (V /V ) F B S 及 0.5% (V /V ) T w e e n 20 稀释缓冲液： P B S ，含 1 % (V /V ) F B S 标准品，比 如 鼠 IgGl X 链 标 准 品 （Pharniingen) 或 M H C -I g 标 准 品 （Pharmingen) 样品 ：含 M H C -I g 的 上 清 （见基本方案） 辣根过氧化物酶偶联的羊抗鼠X 轻 链 二 抗 （抗 鼠 I H R P ， Southern Biotechnology) 终末洗涤缓冲液： P B S ，含 0.5% (V /V ) T w e e n 20 显色剂 ： T M B —步 法 底 物 系 统 （D a k o ) 0. 5mo l / L H 2S O 4 9 6 孔 E L I S A 板 ：高 蛋 白 结 合 容 量 ，用于酶联免疫检测/放射免疫检测的半域板 (E I A /R I A ； Costar) 9 6 孔板酶联仪， 450n m 1 . 用 含 有 l〇M g/m l 相应抗体的碳酸盐缓冲液包被9 6 孔 E L I S A 板 ，每 孔 50/xl。用羊抗 鼠 I g G l 包被一行对照孔用于鼠I g G l ，每一个样品有半行孔需要用鼠I g G l 标准品测 定 。在另一个板子上，用 抗 鼠 M H C I 类分子单克隆抗体包被，每一个样品包被一
    孔 。每一块板子设置2 孔作为空白，室温孵育Ilu 2 . 向每一^孔中加人50]ul封闭缓冲液，并在室温鮮育> l h 。 3•洗涤板子3 次 ，每一孔每次用200M 1洗涤缓冲液。最后一次洗涤后，去除所有残留的 液体，每一^孔中加入50/xl稀释缓冲液。 4 . 用稀释缓冲液配制标准品及样品。将标准品稀释至lOOng/m l ，将样品稀释至标准品 的浓度范围之内。 5 . 在 E L I S A 板子上进行2 倍的连续稀释，将 50/^1的标准液或样品溶液加入第1 行 。从 第 1 行 吸 取 50M 1加 入 第 2 行 ，再 从 第 2 行 吸 取 50W 加 入 第 3 行 ，以此类推。最后一 行则弃掉50M 1。每一块板子上留2 孔 作 为 空 白 （含 50/xl稀释缓冲液，步 骤 3)，室温 孵 育 l h ，每 孔 用 200/^1洗涤缓冲液洗涤3 次。 6 . 向每一孔中加入用稀释缓冲液按1:5000〜1:10 000稀释的抗鼠X-H R P 稀释液，每 孔 50^1，室温孵育30〜45m i n ，每 孔 用 200/xl洗涤缓冲液洗涤3 次 。 7 . 向每一孔中加入50M 1显色剂，等 2〜15m i n 直到标准孔开始变蓝。向每一孔中加人 25]ul 0. 5m o l/L 的 H 2S O 4以终止显色反应。 8 . 将板子的底部擦干净，如果孔中有气泡则将气泡除掉。在 终 止 反 应 后 I O m i n 之内用 9 6 孔板酶联仪在450n m 读取数据。 辅 助 方 案 2 J558L 转染细胞大规模培养及上清的浓缩 材 料 J558L 转 染 细 胞 （见基本方案） 杂交瘤 S F M 培 养 基 （Life Technologies) G 418 (Life Technologies) 1 0 % (m /V ) 叠 氮 钠 （Sigma) 蛋白酶抑制剂，如 苯 甲 基 磺 酰 氟 （P M S F ) 和 亮 抑 酶 肽 （leupeptin) (Boehringer M a n n h e i m ) ，可选 75c m 2 和 175c m 2细胞培养瓶 0.45jLtm 滤膜 蛋白质浓缩系统，如 Hollow Fiber Concentrator (A / G Technology) 或 Centriflo m e m b r a n e cone (C F 50A m e m b r a n e ； A m i c o n ) I•用杂交瘤S F M 培 养 基 将 J558L 转 染 细 胞 以 0•25 X IO6个细胞/m l 的浓度接种至含 20m l 培养基的75c m 2细胞培养瓶中。在 l m g /m l G 4 1 8 的条件下维持培养3d ，这时培 养基应该开始变黄（预期密度为I X l O 6个细胞/m l )。 2 . 细胞扩增培养，从 75c m 2的接种瓶中取15〜20m l 的细胞悬液加入175c m 2的细胞培养 瓶 ，并 加 入 3 倍体积的杂交瘤S F M 培养基，不 加 G 418。 2〜3d 内，加入新鲜培养基 使总量达到175c m 2的细胞培养瓶的最大体积（150〜250m l )。 3 . 用显微镜观察细胞并用E L I S A 测 定 蛋 白 质 的 产 量 （见 辅 助 方 案 1 ) 以确定收获上清 时的最佳细胞浓度。当细胞达到某一密度（如 1.5X 106〜I.8 X 106个细胞/m l ) 并且 活细胞为7 0 % 〜8 0 % 时 ， 4°C ， 300g•离心I O m i n 收集上清。
    4 . 用 0.45M m 滤膜过滤上清，加入叠氮钠至0 . 1 % 以防止污染。如果需要，加入蛋白酶 抑制剂以抑制复合物降解。如 果 1〜2 周内不对上清进行纯化（见辅助方案3)，则将 上清保存于一20°C ，可保存达6 个月。 5 . 用商业化的蛋白质浓缩系统对M H C - I g 二聚体进行浓缩。 杂交瘤S F M 培养基含有大量的胰岛素和转铁蛋白。尽管大多数浓缩技术不能浓 缩胰岛素，但可以将转铁蛋白（分子质量约80 O O O k D a) 与 M H C - I g —起浓缩。如果 需要纯化的蛋白质，则 必 须 将 M H C - I g 与转铁蛋白分开，或者使用别的杂交瘤培 养基。 辅 助 方 案 3 用5-碘-4-羟基-3-硝基酿乙酰-琼脂糖凝胶层析法纯化MHC-Ig 二聚体 pXIg 质粒含有对 4-轻基-3-硝 基 酸 乙 酰 （4-hydroxy-3-nitrophenylacetyl， N P ) 特异 的免疫球蛋白可变区结构域。 材 料 （带V 项 目 见 附 录 1) 5一碘 -4-轻基-3-硝 基 酿 乙 酰 （5-iod〇 -4-hydroxy-3-nitrophenylacetyl， N I P )-琼脂糖凝 胶 树 脂 （见辅助方案4 ) 或 5ml N I P 琼 脂 糖 凝 胶 柱 （BiosearchTechnologies) V P B S 含 M H C - I g 融合蛋白的细胞上清（见基本方案2) V 洗脱缓冲液 P B S ，含 0.02% (m /V ) 叠 氮 钠 （Sigma) Centriflo cones (A m i c o n ) 1 . 可选：用 P B S 配 制 5 0 % (m /V ) N I P 琼脂糖树脂悬液。将 含 有 5m l 填装好的N I P 琼 脂糖的柱子里面的液体倒掉，将柱子在4°C 避光保存。 2 . 使用前，用 3 倍柱床体积的P B S 洗涤柱子。 3 . 用 含 有 M H C -I g 融合蛋白的细胞上清过柱，流速< lml/min (每个柱子的结合容量 通常< 1 0 m g M H C -Ig)。将流出的样品液收集并保存以用于后续的分析及出现问题时 查找原因。 4 . 用 25ml (5倍柱床体积） P B S 洗涤柱子，并让洗涤液完全流出。收集流出的洗涤液 并保存用于后续的分析及出现问题时查找原因。 5 . 加 人 15ml (3倍柱床体积）洗脱缓冲液，收集流出的洗脱液。然后再加入15ml P B S 并继续收集洗脱液直至总体积为25〜30m l 。 6 . 用 4 倍柱床体积的P B S 淋洗柱子并保存于含0. 0 2 % 叠氮钠的 P B S 中。 7 . 用 Centriflo cones浓缩含有二聚体蛋白的洗脱液。 8 . 在 4°C 用 P B S 对 浓 缩 样 品 进 行 透 析 （C P I 附 录 3H ) 以去除游离的3-硝基-4-羟基-酚 乙 酰 -氨 基 己 酸 （3~nitro-4-hydroxy-plienylacetyi-aminocaproic acid， N P -C A P -O H )， 每次用500ml P B S ，一共透析2 或 3 次 。 9•用E L I S A (见辅助方案1 ) 和 （或） S D S - P A G E (单 元 12. 3 ) 对最终得到的蛋白质 进行定量。
    辅 助 方 案 4 制 备 5-碘-4-羟基-3-硝基酚乙酰-琼脂糖凝胶 尽 管 N I P 琼脂糖凝胶已有商业化的产品，但也可以自行按照该方案所描述的方法 大 批 量 制 备 （制成品可以稳定5 年或更长时间）。 材 料 （带V 项 目 见 附 录 1) N -(3-氨丙基)-1，3-丙烷二胺（Aldrich) 浓盐酸 C L -4B 琼 脂 糖 凝 胶 (Pharmacia) 0. lmol/L N a O H 2m o l / L N a 2C O 3 (Sigma) 0. lmol/L N a H C O 3> p H 9. 5 (Sigma) 溴 化 氰 （C N B r ; Sigma) 20m m o l /L 叠 氮 钠 （Sigma)，分另丨 J用水 及 P B S 溶液配制 3 % (W V ) N a H C O 3 (Sigma) 3-硝基-4-羟基-酚乙酰-氨基己酸琥珀酰亚胺酯（N I P -C A P -〇 Sii，相对分子质量为 423 ? Biosearch Technologies) 二 氧 杂 环 己 焼 （dioxane; Aldrich) V P B S I L 锥形烧瓶 I L 的瓶子 I L 玻璃烧结漏斗 注意：此处使用的几种化学品对人体有害。使用时需采取适当的安全防护措施。 注 ：所有的玻璃器材和溶液应该是无内毒素的。将玻璃器材在200°C 烘烤> 4 h ，或 者 用 0 •lmol/L N a O H 浸泡，再用蒸馏水洗，也可以高压消毒。最好所有溶液都用处理 过的玻璃器材配制并立即髙压消毒。 1•在通风柜内，将 160m l i V -(3-氨丙基)-1，3-丙烷二胺倒人一个烘烤过的容量为I L 的 锥形烧瓶里。将烧瓶置于冰上，在 4°C 下 ，用浓盐酸将其p H 调 到 10。 2 . 用下列溶液依次洗涤320ml (1体积）包 装 的 C L -4B 琼脂糖凝胶： 约 10 体积 〇. lmol/L N a O H 5 体积水 2 体积 2m o l / L N a 2C O 3o 3 . 将 2 体 积 N a 2C 〇 3转人一个烤干的I L 的瓶中，置于室温。 4 . 将 IL 0 •lmol/L N a H C O 3置于冰上。在通风柜内，将 IOOg C N B r 置于装有温水的烧 杯 内 融 化 （C N B r 在室温下呈液态）。 5•将16ml C N B r 加入琼脂糖凝胶中并在室温下强力搅拌1〜2h 。 6 . 在 I L 玻 璃 烧 结 漏 斗 上 ，将 琼 脂 糖 凝 胶 沥 干 并 用 1 0 倍 体 积 的 冰 冷 的 0. lmol/L N a H C O 3 (步骤4 ) 洗涤。 7 . 用铲子将活化的琼脂糖凝胶转移到一个I L 的瓶子并加入氨丙基（步 骤 1)。 4°C 搅拌

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    来源：丁香实验

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