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    基本方案1 从淋巴细胞中扩增 RNA

    相关实验：患病个体的序列扩增实验

    最新修订时间：

    材料与仪器

    用 EB 病毒侵袭诱导转化的B细胞 非转化淋巴细胞
    PBS DEPC 4dNTP 混合物 10 X PCR 扩增缓冲液 逆转录酶 Taq DNA 聚合酶 矿物油 筛琼脂糖 DNA 分子大小标准参照物
    聚丙烯微量离心管 循环变温加热器 水浴锅

    步骤

    1. 收集转化的B 细胞，从 30m l 的饱和E B 病毒培养或梯度离心从20〜30m l 新鲜全血 中，利用ficoll-hypaque (聚薦糖泛影钠）从非透明的淋巴细胞中提取（ 这个的总量 限制约为IO9个细胞） 。 2. 用冰冷的P B S 清洗细胞， 300g 4°C 离心5min。 3 . 利用单步硫氰酸胍法从细胞中提取总RNA (单元1 0 . 3 ) 。 4. 微量离心管中用100^1的经D E P C 处理的水重悬R N A ，并等分于两个50jlJ 的管中于 一70°C下 储 存 （ 可稳定保存一年以上） 。预计R N A 的浓度应为lmg/ml (共10(^1)。 5. 在 0 •5m l 微量离心管建立如下2〇4的反应体系： 2jJ I.25mmol/L 4dNTP 混合物； 10X P C R 扩增缓冲液； 500n g 逆 向 （ 反义）外 引 物 （60pmol); 20U RNasin； 2 叫 （2|ul) R N A (第4 步产物） ； 50U 反转录酶； 加经D E P C 处理过的水至20卩1。
    在 42°C 的环境下培养45min。在 90°C 下加热反转录酶lOmin。冷却，高速离心。 散布控制反应（ 除了 R N A 其他条件相同）的测试样本，并在操作过程中的同时进 行。扩增前在4°C 环境下储存c D A N 产物过夜或者储存在一20°C 中。 6. 在 0. 5m l 微量离心管建立如下IOOpJ的反应体系： 164 I.25mmol/L 4dNTP 混合物； 2“ I O X P C R 扩增缓冲液； 500ng 前外引物（ 60pmol); 2( V cDNA (第5 步产物） ； 加经D E P C 处理过的水至lOOjul。 加 2. 5U Tag D N A 聚合酶。混匀，高速离心。如果应用于循环变温加热器则先加2 滴矿物油覆盖。 7. 应用如下程序建立P C R 反应： ' 4 0 个循环： 30s 94°C (变性） Imin 55°C (退火） 2min 72°C (延伸） 最后步骤： 无 定 期 4°C (保存） 8•将l〇 W 第一轮反应的P C R 产物加入到Iml的水中。使 用 5^1这种按1 : 100稀释度 稀释的溶液作为模板进行第二轮P C R 扩增。将第一轮反应的P C R 产物和稀释液4°C 保存，以备日后需要时使用。 9. 对于每一个样品按照下面的设定在0 •5m l 的微量离心管中配置成50|ul的溶液： 8jul I.25mmol/L 的 4dNTP 混合物； 5“ 10X P C R 扩增缓冲液； 250n g 正向引物、 250ng反向引物（30pmol); 5 4 1 :100稀释度稀释的第一步P C R 产 物 （ 来自第8 步） ； 补水到504。 加入I. 2 5 U 的T 叫 D N A 聚合酶。混合，微量离心机最高速离心，如果热循环装 置允许的话在外面涂上矿物油。在平行步骤中对测试样本插入进一步的对照反应 (除非没有第一轮反应的相同产物） 。 10. 应用如下程序建立P C R 反应： 3〇 〜 4〇个循环： 30s 94°C (变性） Imin 55°C (退火） 2min 72°C (延伸） 最后步骤： 无 定 期 4°C (保存） 11. 从第2 步反应中吸取IOjtjJ 产物进行琼脂糖凝胶电泳，并用溴化乙锭染色（ 附录 3G )。包括含有一种已知数量的分子大小标记的（ 电泳）泳道，并进行图像处理。 备选实验方案 改良c D N A 的二次扩增 扩增如异源双链分析或化学裂解可能需要5'-32P— 标记产物。对于这些扩增，二次
    P C R 按描述的那样执行，但是要用末端被标记的引物。这个单个或是双个引物所标记 的 5'端，用 于 [7-32P] A T P 存在的T 4 多核苷酸激酶催化的P C R 反应中。 另外，二次P C R 可以用于利用包含限制性内切核酸酶的引物，以便得到亚克隆的 最终产品，如用于序列测定。酶的切割位点绝不能存在于这个目标D N A 序列中，并应 产生黏性末端使之更有利于克隆到所选择的载体聚合接头上。这两种方法都有必要确保 P C R 产物的高效限制性。第一，寡聚核苷酸引物应该有个从5'端到酶切位点的三核苷 酸残基的“帽”结 构 （ 即其自身V 端到目的D N A 序列） 。第二，由于P C R 反应有产生 不完全末端的趋势，二次P C R 的产物必须被冈琦片段填充，以确保酶切位点的产生。

    来源：丁香实验

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