淋巴细胞增殖实验
最新修订时间：
原理
淋巴细胞在体外经某种物质刺激，细胞代谢和形态相继变化，在24——48h细胞内蛋白质和核酸的合成增加，产生一系列增殖的变化，如细胞变化、细胞浆扩大、出现空泡、核仁明显、核染色质疏松等，由淋巴细胞转变为淋巴母细胞。因此，这种淋巴细胞增殖又叫淋巴细胞转化。据此可判断出淋巴细胞对有关刺激的反应性与功能状态。
（1） 非抗原性刺激物：如植物血凝素（PHA）、刀豆素A（ConA）、美洲商陆（PWM）、脂多糖（LPS），通称促有丝分裂原。其中LPS刺激B细胞，PWM可刺激T和B细胞，PHA和ConA刺激T细胞增殖。
（2） 抗原性刺激物：如结核菌素、葡萄球菌毒素、破伤风类毒素、链球菌激酶、肿瘤抗原、同种异型组织抗原等。
材料与仪器
PBMC细胞悬液
RPMI-10完全培养基 100ug ml的植物血凝素
96孔板圆底细胞培养板
RPMI-10完全培养基 100ug ml的植物血凝素
96孔板圆底细胞培养板
步骤
基 本 方案 丝 裂原 诱 导 的 外 周 血 单 个 核 细 胞 增 殖 实 验
材 料
![P B M C 细 胞 悬 液 （单 元 8.1) V R P M I -I O 完全培养基 100Mg/ml 植 物 血 凝 素 （phytohemagglutinin， P H A ) ， R P M I -10 完全培养基配制 (分装，一20°C 保存） 9 6 孔圆底细胞培养板 1•计数P B M C (附录3A ) ，加 入 R P M I -10完全培养基，调整浓度至I X l O 6个细胞/ml。 细 胞 混 匀 后 ，在 9 6 孔 板 每 孔 中 加 入 IOOm I 细 胞 悬 液 （每 孔 I X IO5个 细 胞 ；图 8.8. 1)。各实验组设3 复 孔 （如丝裂原的不同浓度组）。不加丝裂原的对照孔作为本 底 ，同样设3 复孔。 2•用 R P M I -10 完全培养基将 100Mg/ml P H A 分别按 1 : 10、 1 : 20 和 1 : 40 (V 7V ) 进 行稀释。在 9 6 孔 板 的 第 1〜3 列 （本底）每 孔 中 加 入 IOOmI R P M I -10完全培养基; 在 第 4〜6 列 中 加 入 1 : 4 0 稀 释 的 P H A 溶 液 IOOiUl (终 浓 度 2. 5]ug/ml) ，在 第 7〜9 列中加入1 : 2 0 稀 释 的 P H A IOOmI (终 浓 度 5Mg/ml) ，在 第 10〜1 2 列 加 入 1 •• 1 0 稀 释 的 P H A IOOmI (终 浓 度 10Mg/ml)。操作时应避免不同浓度或不同样品间的交叉污 染 。培养板 置 37°C ， 5 % C 0 2细胞培养箱中培养3d 。 3. 3H T d R 掺入及后续检测参见辅助方案](http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2016/07/B1469684796493gym5kcxbxzpng_small.jpg)
备 选 方 案 1 单向混合淋巴细胞反应
附 加 材 料（其他材料见基本方案）
R P M I 完 全 培 养 基（R P M I -10A B ) (附录 1 ) : 含 1 0 % 人 A B 血清， 56°C ， I h 灭活
同种异体刺激细胞（P B M C ; 单 元 8.1)
自体刺激细胞（P B M C ; 单 元 8. 1)
丝裂霉素 C 溶 液 ， 0.5m g /m l ， R P M I -10A B 配 制（避 光 ，无沉淀），或细胞照射二活设备
![备 选 方 案 2 抗 原 诱导 的T 细胞增殖实验 此方法经调整后也适用于蛋白质或多糖抗原诱导的T 细 胞 增 殖 实 验 （表 8. 8. 2)。 附 加 材 料 （其他材料见备选方案1) T 细 胞 （单 元 8, 2 和 8. 3) 自体抗原呈递细胞（非 T 细胞；单 元 8. 2 和 8. 5) 破 伤 风 毒 素 (Connaught ^ State Laboratory Institute of Massachusetts) 1 . 计 数 丁 细 胞 （附录3八），用1^^1-10八8完全培养基调整浓度至1\106个细胞/1111。 2 . 参照备选方案I 中步骤2 , 用丝裂霉素C (或 2500rad照射）灭活抗原呈递细胞。调 整浓度至2 X IO5个细胞/ml。 3 . 在 9 6 孔板中加入IOOm I T 细胞悬液和50M1灭活后抗原呈递细胞悬液，每种细胞在加 样前应混勻。加入破伤风毒素至终浓度分别为〇、 1、 5 、 1 0 和 20pg/m l 。每浓度设3 复孔。培养板置37°C ， 5 % C 0 2细胞培养箱中培养6d 。 4. 3H T d R 掺入及后续检测方法参见辅助方案。 辅 助 方 案 3H TdR 掺入和细胞收集 材料 50/xCi/ml 3H TdR [6. 7Ci/(mmol/L) ; Amersham 或 ICN Biomedicals] ， RPMI-10 培 养 基 配 制 （附 录 1) 100% C W V r) 甲醇 闪 烁 液 （ Ready Safe 或 Beckman) 同 步 细 胞 收 集 器 （推 荐 使 用 半 自 动 收 集 器 ； Cambrige Technology， Beckman， Pharmacia L K B Biotechnology 或 Skatron)，蒸锻水及蒸傭水罐 细胞收集器配套用滤纸，临用前用蒸镏水浸湿 灯 和 镊 子 （推荐使用） 液闪管 1 . 细胞培养终止前611或18}1，在每孔中加入2(^1浓度为5(^(：丨 /1111的3； «丁(111(每孔 1.0|^〇 )。可适当延长311丁411掺入时间。 2 . 使用全自动同步细胞收集器，洗涤、裂解细胞，并 将 D N A 转移到滤纸上。每列细胞 洗涤及吸引至少1 0 次以确保细胞D N A 被充分转移至滤纸上，且彻底洗掉未掺入的 3H T d R 。 1 0 0 % 甲醇洗涤滤纸条，使滤纸条易于干燥。使用半自动细胞收集器时， 需将滤纸片放入对应的闪烁管中。人工收集时，将滤纸片置灯下烘干，然后用镊子 将滤纸加入对应的闪烁管中。最后在闪烁管中加入闪烁液。 3 . 用液闪仪检测样品的c p m 值 ，要求标准差< 2 % 。计算本底和 样 品 的 平 均 c p m 值 复孔的变异度应〈 2 0 % 。 4 . 根据仪器使用说明书彻底清洗细胞收集器。](http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2016/07/B1469684835546af5jfadmcnpng_small.jpg)
注意事项
1. 细胞培养液终止前6h或18h，在每孔中加入20μL浓度为50μCI/ML的氘代TDR，可适当延长TDR渗入时间。
2. 根据仪器使用说明书彻底清洗细胞收集器
常见问题
使用全自动同步细胞收集器，洗涤，裂解细胞，并将DNA转移到滤纸上，且彻底洗掉为渗入的氘代TDR，100%甲醇洗涤滤纸条，使滤纸条易于干燥，使用半自动细胞收集器时，需将滤纸片放入对应的闪烁管中，人工收集时，将滤片置于灯下观察烘干，然后用镊子将滤纸加入对应的闪烁管中，最后在闪烁管中加入闪烁液。
本实验来自《精编免疫学实验指南》，作者：J.E.科利根等,译者：曹雪涛等
本实验来自《精编免疫学实验指南》，作者：J.E.科利根等,译者：曹雪涛等
来源：丁香实验
