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    α-、 β-和 γ-干 扰 素 诱 导 的 抗 病 毒 活 性 的 检 测

    相关实验：α-、 β-和 γ-干扰素诱导的抗病毒活性的检测

    最新修订时间：

    材料与仪器

    步骤

    基 本 方 案 小 鼠 干 扰 素 诱 导 的 抗 病 毒 活 性 的 检 测

    材 料

    干扰素敏感的 L 929 成纤维细胞

    E M E M 培 养 基（Eagle 氏最低要求培养基）

    胰酶消化液
    检 测 样 品（具干扰素活性的血清或培养上清）

    小鼠干扰素的参照标准品 α -干扰素、β-干扰素、 γ-干 扰 素 以 及 αβ-干扰素（从美国马里兰州贝塞斯达国家过敏与感染疾病研究院 Laughlin 博士处获得）

    水 疱 性 口 炎 病 毒（vesicular stomatitis virus， V S V ; 印第安纳株）

    4°C 的 EBSS (Earles 平衡盐溶液）

    5 % (W V ) 福尔马林

    含 0.05% (m /V ) 结 晶 紫 的 2 0 % 乙醇

    1 0 0 % 甲 醇（可选）

    75c m 2 的直颈组织培养瓶（Falcon 或 Costar)

    8 通 道 微 量 移 液 器（固定或调整至 50M1 和 IOOiLd; Costar)

    9 6 孔 平 底 微 孔 板（Falcon 或 Costar)

    8 孔 吸 液 器（D r u m m o n d ; Thomas Scientific)

    倒置显微镜

    定 轨 摇 床（可选）

    微量 滴 定 板 读 板 仪（酶联仪）（可选）

    1 . 将 约 I X l O6干 扰 素 敏 感 的 L 9 2 9 成 纤 维 细 胞 悬 于 25 ml E M E M 培 养 基 中 ，接种至75 cm2 组织培养瓶。在 37°C ， 6%(：〇 2 培养箱中培养约 1 周（或直至铺满培养瓶）。

    2 . 向铺满细胞的培养瓶内加入 3m l 胰酶消化液，待细胞从培养瓶底脱离下来后收集获
    取 L 929单细胞悬液。并 用 E M E M 培养基以2 X 106个细胞/m l 的浓度重悬细胞。 3 . 用 8 通道微量移液器向9 6 孔平底微孔板加入50^1/孔 的 E M E M 培养基。每加一行 检测样品就同时设置一行参照标准品。 4 . 加 入 50M1 1 号样品至A 行 的第3 孔。依此类推将2〜7 号样品分别加入B 〜G 行的第 3 孔 。 H 行 的 第 3 孔 加 入 50^1含 lOOU/m l 小鼠干扰素参照标准品的E M E M 培养基。 5 . 倍比稀释干扰素样品，温和混勻第3 孔中内容物并吸取50M1至 第 4 孔 。依此类推直 至 第 1 2 孔 ，并 从 第 1 2 孔中弃去50/xl。 6•向每孔加入50/xlL9 2 9 成纤维细胞。用 手 温 和 旋 转 培 养 板 以 使 细 胞 均 勻 分 散 。在 37°C ， 6 % C 0 2培养箱中孵育过夜。 7 . 用 E M E M 培养基稀释V S V 至 适 宜 浓 度 （见辅助方案1)。用 8 孔吸液器吸出每孔中 的上清，吸取时将培养板倾斜一定的角度以防板底的细胞被吸液器的吸头破坏。 8 . 从 第 2 列幵始，向每孔加入IOOm I病 毒 至 最 终 M O I 值 为 0.1 (M O I : 病毒对细胞的 感染比率）。向 第 1 列的每孔中加入IOOptl的 E M E M 培养基。 37°C ， 6 % C 0 2培养箱 中孵育24h 。 9 . 在倒置显微镜下观察单层细胞。在未感染的对照孔（第 1 列）中单层细胞是规整的， 而病毒感染的阳性对照孔（第 2 列 ；无 IFN) 中细胞被完全破坏（即 1 0 0 % 细胞病变 效 应 或 C P E )。 1 0 . 用 8 孔吸液器吸出每孔中的上清。用 IOOjuI 预 冷 的 E B S S 液洗涤。剧烈的摇动培养 板 （或置于定轨摇床上振荡15s) 使细胞碎片脱落。重 复 2 次 。 11•弃去最后一次洗液并加入IOOjul/孔 5 % 福尔马林。室 温 放 置 lOmin。在有水流的情 况下将板中的福尔马林摇至水池中。 1 2 . 每孔加入100/xl结晶紫溶液。室 温 放 置 lOmin。用流水冲洗培养板，并在吸水纸上 扣干。 13a. 观察培养板的情况并进行评价（可以用较少的时间得到一般的精确度）：将各样品 稀释浓度中第一个出 现 等 同 于 病 毒 阳 性 对 照 孔 （第 2 列 ，应 当 约 为 1 0 0 % C P E ) C P E 的孔定义为终点。将 滴 度 倒 数 （U /m l 表示）与参照标准品的终点进行比较。 例如，如果干扰素参照标准品的终点是第9 孔并且终浓度为100U /m l ，样品 的终点是第1 0 孔 ，则待测样品的抗病毒活性为标准品的2 倍 ，即 200U /ml。 将 5 0 % C P E 的孔作为终点可以提高检测的灵敏度，但是如何从肉眼观察的角 度上定义5〇 %C P E 较为困难。 13b. 釆用分光光度法测定样品（较精确）：每 孔 加 入 100^1 1 0 0 % 甲醇并轻轻搅动以洗 去细胞上的染料。立即用读板仪在595n m 波 长 处检测每孔的吸光度（甲醇的蒸发 会导致度数的不精确性）。将 病 毒 对 照 孔 （第 2 列）作为分光光度法的本底对照。 将 未 感 染 细 胞 （第 1 列）的平均595n m 的吸光度作为0 % C P E 。将 产 生 50% C P E 的孔定义 为 终 点 （即吸光度约为未感染细胞对照孔的1/2)。对于每个样品，比较 其终点与参照标准品的终点，如上所述

    辅 助 方 案 1 病毒培养体系的建立

    附 加 材 料

    Vero 细 胞 （ ATCCttCCL 81) 150cm2的组织培养瓶 水平滚瓶器 1. 37°C ， 6 % 0 3 2培养箱中EMEM培养基培养Vero 细胞直至铺满150cm2的组织培养瓶 (约 2. 5 X I O 7个细胞/瓶）。 2. 2. 5 X I O 5P F U (蚀斑形成单位， Plaque Forming Unit， P F U ) 的 V S V 加入至 3ml 的 E M E M 培养基里感染单层细胞。在培养箱中的滚瓶器上孵育45miri使病毒进入至细 胞中。 3 . 加入121111£¥£^1培养基培养2411。当 细 胞 < 5 0%汇 合 生 长 时 （即 >50%〇 ?£)收 集 上清，在台式离心机中以50g 的转速离心IOmin除去细胞碎片。 4 . 收集富含病毒的上清并放置于冰上。在 冰 上 0.5〜1.0m l 等分。储存于一70°C (不能 储存于一20°C )。 5•采用蚀斑法测定所储存病毒株的滴度（Vogel and Fertsch， 1987)。测 定 V S V 病毒 株 的 P F U /m l 值 。 6 . 确定在抗病毒检测中所使用的浓度。计 算 0. I M O I (病毒颗粒与细胞为1 : 1 0 ) 时 ， 感 染 96孔微孔板中2X IO5个细胞/孔的单 层L929细胞所需的病毒液浓度。 L929细胞铺满微孔板的数量大约是2X105个细胞/孔。如 果 VSV病毒液的浓度 是 IXlO9PFUAnU用 EMEM培 养 基 1 : 5000稀 释 病 毒 液2X105PFU/ml， 感染细 胞时每孔加IOOjUil (总量2X104PFU)。 7 . 为了优化抗病毒检测的条件，使用上述稀释度以及其2 倍 或 1/ 2 的稀释度进行检测。 应 该 在 24h 内观察到完全的C P E 。

    辅 助 方 案 2 抗体中和实验

    抗体介导的干扰素诱导的抗病毒活性的逆转可以用来区分样品中发挥抗病毒活性的 干扰素的种类，或者用来检测特定种类干扰素的特定的抗体制品。 1 . 用 E M E M 培养基将待检测抗体进行2 倍系列倍比稀释，终体积为IOOm I/孔 。 2 . 基本方案中所测定的相应干扰素样品的浓度调整为20U /ml。每孔加入50/xl。 此 实 验 中 必 须 测 定 干 扰 素 的 浓 度 [在 对 照 抗 体 和 （或） E M E M 存在情况下]， 以确定其对V S V 感染的细胞的1 0 0 % 的保护效应。而且，也应设立病毒对照孔，以 确定可发生1 0 0 % 的 C P E 。 3 . 每孔加人50M1 L 929成纤维细 胞 悬 混 液 （干扰素终浓度5U /ml)。用手轻轻悬转培养 板使细胞均勻分散。 37°C ， 6 % C 0 2培养箱中培养24h 。 4 . 吸出孔中液体，感 染 V S V (见基本方案，步 骤 9)。 5 . 感 染 约 24h 后 ，显微镜下观察病毒对照孔，收集 ，洗涤，固 定 并 染 色 细 胞 （见基本 方案，步 骤 10〜11)。分 光 光 度 计 读 板 （步 骤 13b)

    6 . 测定抗体制品的中和滴度，即中和掉 5 0 % 的 5U /m l 干扰素活性的抗体的最髙稀释度的倒数。

    7 . 可选操作：抗体的中和活性以 U /m l 表示。效价乘 以 5 (调 整 为 中 和 5U /ml) ，再乘以 4 (调整为相对于加入的样品和细胞 4 倍稀释度的抗体），然 后 再 乘 以 5 (因为检测的体积为0.2 ml)。

    备 选 方 案 人 干 扰 素 诱 导 的 抗 病 毒 活 性 的 检 测

    人 的 CX -、卩-和7-干扰素的检测与小鼠的干扰素的检测步骤除了以下所列其余均 相同。 附加材料 脑 心 肌 炎 病 毒 （ encephalomyocarditis virus， EM CV ) (A T C C # V R 129B) 人 干 扰 素 参 照 标 准 品 （从 美 国 马 里 兰 州 贝 塞 斯 达 国 立 过 敏 与 感 染 疾 病 研 究 院 Laughlin博士处获得） 人 二 倍 体 成 纤 维 细 胞 （ FS-4; Havell， Vilcek， 1 9 7 2 ) 人 2 1 三 体 细 胞 系 (G M 2504; Preble ， 1982 ) ，或 人 肺 癌 细 胞 系 （A 549; A T C C # C C L 185) 1 . 在 L 929成纤维细胞中培植髙滴度E M C 株 ，采 用 0. I M O I (见辅助方案1)。 2 . 用 E M C 病 毒 检 测 人 细 胞 （见基本方案，步 骤 8〜15)。检 测 or和卩-干扰素时采用人 二倍体成纤维细胞，如 FS- 4 , 或者为达到极高的灵敏度采用人2 1 三体细胞系，如 G M 2504。检 测 7-干扰素采用人肺癌细胞系。
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    来源：丁香实验

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