材料与仪器
步骤
基 本 方 案 1 通 过 道 威 克 斯（DOWEX) 离 子 交 换 层 析 分 析 [3H] 肌醇磷酸
材料
![细 胞 （如肿瘤细胞系、杂交瘤、克隆、凝集素刺激的细胞） 添加了 2〜20MCi/ml [3H ] 肌醇的培养基 平衡盐溶液，或类似的盐溶液，或无抗生素的R P M I 1640-10 10〜20mmol/L LiCl (可选） 刺激物 冰预冷的1 0 % (m / \ 0 三 氯 乙 酸 （T C A ) ，或 50 : 100 : I (V A V V ) 氯仿/甲醇/ 浓 H C l 或高氯酸 未标记的 Ins(l，4,5)P 3和 Ins(l，3,4,5)P4 [用于 H P L C 分析 Ins(l，3,4,5)P4] 水饱和乙醚 1 : 100稀释的浓氨水 〇 .5g/m l 道威克斯1-X 8 树 脂 （100〜2 0 0 目；甲酸盐形式； Bio-Rad) 混悬于水 60m m o l /L 甲酸納/5m m o l /L 四硼酸二钠 0. 2mol/L 、 0 •4m o l / L 和 0. 8m o l / L 甲酸铵/0. lmol/L 甲酸 闪 烁 液 （可与含水样本相容；如 Biosafe II， Research Products) 13m m X I O O m m 玻璃管](http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2016/07/A1469513001651devrzqenjfpng_small.jpg)
![直 径 0. 6c m 的一次性柱子 I. 2 X 106〜2 X 107个细胞/样 本 在 含 有 2〜20/xCi/m l [3H ] 肌醇的培养基中，于 37°C ， 5 % C O 2培养箱中培养72h 。 2•用台式离心机300g 离心洗细胞， 3 遍 ，弃上清，重悬于平衡盐缓冲液中。不可含新 霉素及其类似物。 3•吸取200M1细 胞 悬 液 （2 X 106〜IO7个细胞）至一个微量离心管，于 37°C 培养。加入 刺激物或适当的对照。如果要研究两种细胞发生的相互作用，在检测开始时将细胞 沉淀，以促进细胞之间接触。 4 . 在适当的时间间隔加入I m l 冰预冷的1 0 % T C A 裂解细胞。或 者 ，加 入 50 : 100 : 1 (V /V /V ) 氯仿/甲醇/浓 HCl (如基本方案2 中描述的）或髙氯酸来终止反应。如果 要以 H P L C 来分析 Ins(l ，3,4,5)P4, 则加入未标记的 Ins(l ，4,5)P 3和 Ins(l ，3,4,5) P4各 20/xg。涡旋混勻并冰浴30min。 4°C ， 12 000容微量离心101^11。 5 . 将上清移至玻璃管中。在通风橱内，加 入 I m l 水饱和乙醚用于萃取酸，用巴斯德吸 管吸取上层液体并保留。重复萃取4 或 5 次 。 6. 用 1 : 100稀 释 的 浓 氨 水 （根据不同样本确定用量） 中 和 样 本 （以 p H 试纸确定）， 再 加 入 4m l 水 。以 道 威 克 斯 柱 （步 骤 7〜1 2 ) 或 H P L C (见备选方案）分析样本。在 4°C可保存数日。 7 . 吸 取 I.2m l 的 0. 5g / m l 道威克斯混悬物至直径0 •6c m 的柱中制备纯化柱。首次实 验 ，加 入 [3H ] InsP标准品；否则加入待测样本。 8•用30m l 的 60m m o l / L 甲酸钠/5m m o l / L 四硼酸钠盐洗柱，收集 最 后 I m l 洗脱液用于 闪烁记数。确保放射活性已恢复至洗脱[3H ] 肌醇前的背景水平。 9 . 以 6m l 的 0.2m o l / L 甲酸铵/0. lmol/L 的 甲 酸 洗 脱 [3H ] InsP1，每 份 2m l 洗脱 液 。 如果是用标准品进行的预实验，确 定 [3H ] InsP1 存 在 于 一 份 2m l 的洗脱液中。以 2m l 同样的缓冲液洗柱。 10•以16m l 的 0.4m o l / L 甲酸铵/O.lmol/L的 甲 酸 洗 脱 [3H ] InsP2，每 份 2m l 洗脱液。 如果是用标准品进行的预实验，确 定 [3H ] InsP1 存 在 于 一 份 2m l 的洗脱液中。以 6m l 同样的缓冲液洗柱。 11•以IOml的 0. 8m o l / L 甲酸铵/0. lmol/L的 甲 酸 洗 脱 [3H ] InsP3, 每 份 2m l 洗脱液。 如果是用标准品进行的首次实验，确 定 [3H ] InsP1 存 在 于 一 份 2m l 的洗脱液中。 以 6m l 同样的缓冲液洗柱。 12.加 入 16m l 的闪烁液于2m l 的洗脱液中。以液体闪烁计数器检测每分钟的记数，共 记 5min0](http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2016/07/A1469513019335v2tmqu2zu2png_small.jpg)
备 选 方 案 通 过 HPLC 方 法 分 析 [3H] 肌醇磷酸
附加材料
[3 H ] InsP 样 本（见基本方案，步 骤 6) 和标准品
除 气 的 H PLC 级水
2mol/L 的甲酸铵，以磷酸调至 pH3.7
![Whatman Partisil 10 SAX 柱 （undefined 46c m X 25c m ， IOym 微粒大小）和填充有 Whatman 薄壳型阴离子交换剂的保护柱 1 . 在分析样本前先在S A X 柱上先确定相关标准品的洗脱方案，如 Ins(l，3,4)P 3 (约 48min)、 Ins(l ，4 ，5)P 3 (约 52min)、 Ins(l ，3 ，4 ，5)P4 (约 78min)0 2• 注 入 [3H ] InsP样 本 至 S A X 柱 。 3 . 全程采用1.2ml/m i n 的流速，以除气的H P L C 级水洗 柱 lOmin。以除 气 的 H P L C 级 水 和 2mol/L 甲 酸 铵 建 立 线 性 梯 度 。使 用 O 〜 0.8m 〇l/L 甲 酸 铵 的 线 性 梯 度 洗 脱 30min，将 InsP1 和 InsP2 洗脱于每份Imi n 的洗脱液中。维 持 0 •8mol/L 甲酸铵的浓 度 18min，洗 脱 Ins(l，3,4)P 3和 Ins(l ，4,5)P3于每份0.5m i n 的洗脱液中。根据线性 梯度增加甲酸铵的洗脱浓度至1.8m d /L ，洗 脱 15min，将 Ins(l ，3,4,5)P4洗脱至每 份 Imi n 的洗脱液中。 4 . 使用完毕后用水洗涤柱子24h ，用 甲 醇 保 存 （沉淀甲酸铵，填满柱子）](http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2016/07/A1469513036998kmy8zyfwczpng_small.jpg)
基 本 方 案 2 通过薄层层析方法分析肌醇磷脂
材 料
1 % (m/V ) 草酸钾/2m m ol/LED TA
溶剂： 60 : 20 : 23 : 18 : 12 (V7 V /V7 V 7 V ) 氯仿/甲醇/丙酮/乙酸/水 ，或 45 :35 : 10 氯仿/甲醇/4mol/L NH4OH
细 胞（如肿瘤细胞系、杂交瘤、克隆、凝集素刺激的细胞）
无 磷 酸 盐 的 培 养 基（如 GIBCO/BRL) 含 有 1 0 % (V /V ) 热 灭 活 的 胎 牛 血 清(FCS) ， 用 HBSS 或 TBS (附录 1 ) 透析以去除磷酸盐
![Whatman Partisil 10 SAX 柱 （undefined 46c m X 25c m ， IOym 微粒大小）和填充有 Whatman 薄壳型阴离子交换剂的保护柱 1 . 在分析样本前先在S A X 柱上先确定相关标准品的洗脱方案，如 Ins(l，3,4)P 3 (约 48min)、 Ins(l ，4 ，5)P 3 (约 52min)、 Ins(l ，3 ，4 ，5)P4 (约 78min)0 2• 注 入 [3H ] InsP样 本 至 S A X 柱 。 3 . 全程采用1.2ml/m i n 的流速，以除气的H P L C 级水洗 柱 lOmin。以除 气 的 H P L C 级 水 和 2mol/L 甲 酸 铵 建 立 线 性 梯 度 。使 用 O 〜 0.8m 〇l/L 甲 酸 铵 的 线 性 梯 度 洗 脱 30min，将 InsP1 和 InsP2 洗脱于每份Imi n 的洗脱液中。维 持 0 •8mol/L 甲酸铵的浓 度 18min，洗 脱 Ins(l，3,4)P 3和 Ins(l ，4,5)P3于每份0.5m i n 的洗脱液中。根据线性 梯度增加甲酸铵的洗脱浓度至1.8m d /L ，洗 脱 15min，将 Ins(l ，3,4,5)P4洗脱至每 份 Imi n 的洗脱液中。 4 . 使用完毕后用水洗涤柱子24h ，用 甲 醇 保 存 （沉淀甲酸铵，填满柱子）](http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2016/07/A1469513056960eeanfmzytkpng_small.jpg)
![2 . 将滤纸排列在T L C 缸中，用足够盖住硅胶板底部0.5c m 的溶剂进行平衡> 6 h 。如果 使 用 [3H ] 肌醇标记的样品，则 采 用 45 •• 35 : 1 0 氯仿/甲醇/4m 〇l/L N H 4O H 作为 溶剂系统。 3 . 用 [32P ] 正磷酸盐进行无平衡标记时，以无磷酸盐的培养基/10% F C S 洗细胞并重 悬于此培养基中。用微量离心管分装为每管0.2m l ， 37°C 孵育。加 入 无 载 体 的 [32P ] 正磷酸盐至终浓度0.1〜l.OmCi/m l 。孵 育 3min，然 后 加 入 刺 激 物 （如 果 用 [32P ] 正磷酸盐进行标记，则需溶于不含磷酸的液体中）或稀释液对照。在计时上要精确， 并使用重复的细胞样品（如 3 个重复样品）。如 检 测 [3H ] 肌醇脂类，则用标记培养 基 进 行 刺 激 （推荐）。 4 . 加 人 0.8ml 50 : 1 0 0 : 1 (V /V /V ) 氯仿/ 甲醇/H C l来 裂 解 细 胞 （细胞来自本方案步 骤 3 或者基本方案1 的步骤 3 ) 。 5•加入 0.03ml 100mmol/L E D T A ， p H 7. 4 ， 0.1ml 100mmol/L K C 1， 0.15ml 氯 仿 ， 0.15m l 水 ，涡旋混匀几秒钟。微量离心2min，移 去 低 层 相 （含有脂类）。 6 . 向剩余的上层相中加入0.4m l 氯仿，涡旋混勻，微 量 离 心 2min，移去低层相并与步 骤 5 中的低层相混合。在氮气中干燥。如有必要，盖上盖子4°C 存放过夜。 7 . 重新溶解于50M1 2 : 1 氯仿/甲醇中，迅速点样20jul于 硅 胶 板 上 （来 自 步 骤 1)，距离 底 部 Icm (用铅笔做标记）。在每块板上层析PI、 PIP、 PIP2和 P A 标 准 品 （每种2〜 4/xg) 。 室温风干。 8 . 将层析板放置于预平衡的T L C 槽 中 （来 自 步 骤 2)，使 其 高 度 达 到 15cm ( 约 lh)。 100°C干燥 3min。 9 . 在通风橱中用碘蒸气预平衡T L C 缸几分钟。将板子放置在预平衡的T L C 缸 中 3〜 5m i n 使 标 准 品 显 色 （黄色-橙 色 ，会退色）；用铅笔对其进行标记。样 品 中 的 PI (但 不 是 P I P 和 PIP2) 同时显色。 10. 用 Kodak X -O m a t 胶片对板子进行自显影，曝 光 几 小 时 （[3H ] PIP2 需在一 80°C曝 光 达 2 周）。如 果 使 用 [3H ] 肌醇标记的样品，则 在 自 显 影 前 用 E N 3H A N C E 喷洒 层析板，在通风橱中风干过夜。 11. 从层析板上刮下目标脂类，用液体闪烁分光法对放射性进行定量。](http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2016/07/A1469513072260ir4fu6i9wtpng_small.jpg)
来源：丁香实验
