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    制备小鼠T细胞杂交瘤

    相关实验：制备小鼠 T 细胞杂交瘤

    最新修订时间：

    材料与仪器

    步骤

    基 本 方 案 细 胞 融 合 和 T 细胞杂交瘤的选择

    材 料（带 V 项 目 见 附 录 1)

    小 鼠（用于体内可溶性蛋白或蛋白肽致敏 T 细胞的制备）

    完全弗氏佐剂

    反 应 细 胞（未致敏的淋巴结 T 细胞）和用于再次混合淋巴细胞反应中激活 T 细胞

    用 的 刺 激 细 胞（表达所需同种异型抗原的脾细胞）

    B W 5147 淋 巴 瘤 细 胞 系（A T C C # TIB4 8 , 全 名 为 B W 5147.G .4.1，药物标记，在H A T 培养基中死亡，对 6-硫鸟嘌呤抵抗）D M E M - I O 和 D M E M - I O 完全培养基 可溶性蛋白抗原和抗原呈递细胞（单 元 2. 11) V 2 X H A T 平面培养基 洗涤培养基：不 含 F B S 或 H E P E S 的 D M E M 含 5 0 % (m /V ) P E G 溶液 lmol/L H C l 或 N a O H (可选使用） 小 鼠 胸 腺 细 胞 （与反应性T 细胞同基因，单 元 2.1) 10_4mol/L 6-硫 鸟 嘌 呤 （Sigma，可选择的） V 新鲜制备的I X H T 平面培养基 25c m 2、 75cm2、 175cm2 组织培养瓶 400ml 和 600ml 烧杯 计时器 生物安全柜 4m l 和 50m l 聚丙烯圆锥底离心管 带 Sorvall H -1000B 转 子 （或相当的）的低速室温离心机 lml、 2ml 、 IOml 和 25 ml 吸管 9 6 和 2 4 孔细胞培养板 la. 获得能与可溶性抗原反应的T 细胞：融合前两周，用完全弗氏佐剂乳化待测抗原后 免 疫 3 或 4 只 小 鼠 （单 元 2. 1 1 和单元2. 12)。 lb. 获得能与同种异型抗原反应的T 细胞：融合前两周，用未致敏 的 淋 巴 结 T 细胞作 为反应细胞，用表达同种异型抗原的脾细胞作为刺激细胞，激发初次混合淋巴细胞 反 应 （单 元 2. 1 1 和单元2. 12)。 2 . 融合前一周，在 37°C 用 D M E M -I O 完全培养基培养扩增B W 5147细 胞 ，确保到细胞 融合当天有> 1 X 1 0 8 个对数生长期的淋巴瘤细胞可用。当细胞浓度达到I X l O 6 个细 胞/m l 时 ，将 B W 5147细胞转移到新鲜的培养基中。在这一周中不要让细胞过度生 长 ，不要让培养基过酸（颜色变黄）。为达到最佳结果，在融合当天细胞活力应接近 100% ( > 9 5 % ) ，并且要避免支原体的污染（附 录 3F )。 3a. 对于淋巴结T 细胞：融 合 前 3d ，用合适的抗原和抗原递呈细胞体外刺激抗原致敏 的小鼠来源的淋巴结T 细 胞 （单 元 2. n 和单元2. 12)。 3b. 对于同种反应性T 细胞：融 合 前 3d ，再次刺激来源于初次混合淋巴细胞反应体系 的同种反应性T 细 胞 （单 元 2. 12)。 4•融合前一天，用新鲜的D M E M -10完全培养基将B W 5147淋巴瘤细胞按1 : 5 比例传 代 （3 个 175c m 2 组织培养瓶，每 瓶 含 100ml I X l O 5〜2 X 105 个细胞/m l 以期在融合 当天收获> 1 X IO8 个细胞）。 5 . 准 备 2 X H A T 培养基、 D M E M -20完全培养基和含5 0 % P E G 溶 液 。用 50m l 离心管 分 装 2 X H A T 培养基和D M E M -20完 全 培 养 基 （每 种 3 管），用 4m l 离心管分装2ml P E G 溶液。 6 . 融合当天， 37°C 水浴预热以下容器和试剂： 分别装有 7 5m l 水 的 3 个 4 0 0m l 和 3 个 6 0 0m l 烧杯 ；
    分 装 于 4 个 50m l 离心管的中200m l 无菌洗涤培养基； 2m l 分 装 于 4m l 离心管的5 0 % P E G 溶液； 50m l 分 装 于 50m l 离心管无菌的D M E M -20完全培养基。 7 . 设置离心机的温度到室温，并在层流净化柜中放置一个计时器。 8 . 准备胸腺细胞悬液用于步骤2 0 中 融 合 细 胞 的 铺 板 （单 元 2.1)，用 50ml D M E M -20 完全培养基调整细胞浓度为5 X 106〜I OXlO6 个细胞/ml (此体积正好用于5 块平板 的实验）。 9 . 从培养体系中收集活化的T 细胞 ，用 Ficoll-Hypaque离 心 去 除 死 细 胞 （单 元 2.1)。 用洗涤培养基洗最后一遍。 10. 在 收 集 T 细胞的过程中，同 时 收 集 B W 5147细 胞 并 用 Sorvall H -1000B 转子室温， 200g 离心洗漆。 11. 在 层 流 净 化 柜 中 装 配 3 个 37°C 水 浴 装 置 ，将 一 个 400m l 盛 有 37°C 水的烧杯置于 600m l 盛 有 37°C 水 的 烧 杯 中 （来自步骤6)。在每个水浴中，放置一个装满洗涤培养 基 的 50m l 离心管，一个装满D M E M -20完全培养基的50m l 离心管和一个装有2ml 5 0 % P E G 溶 液 的 4m l 离心管。如 果 P E G 溶 液 偏 碱 性 （显示紫色），加 适 量 lmol/L H C l 中和，如 果 偏 酸 性 （显示黄色）则加适量lmol/L N a O H 中和。 12. 计 数 T 细胞和B W 5147细 胞 并 检 测 细 胞 活 力 （只 有 接 近 1 0 0 % 时才能使用）。将装 有细胞的离心管置于层流净化柜中的水浴中。再 将 装有胸腺细胞的离心管放入 水浴。 13. 将 B W 5147细胞和活化的T 细 胞 以 I : 1 的 比 例 在 50m l 聚丙烯圆锥底离心管中混 合 ，加 20m l 37°C 的洗涤培养基。当第一次用特别批次的B W 5147细胞做融合时， 推荐做比例梯度， B W 5147细 胞 ： T 细 胞 从 1 : 10、 1 : 3 到 1 : 1。 14. 室温， 800g•离心 5min。 15. 用连于真空烧瓶的无菌吸管吸去上清，并将离心管置于其中一个水浴中。 16. 用 I m l 的吸管将I m l 预 热 的 5 0 % P E G 洗涤培养基逐滴加入到沉淀的混合细胞中， 从第一滴开始计时，每次加一滴， Imiri内加完，每一滴后用吸管末端轻柔地混匀 细胞，每次都需 不 断 地 搅 拌 。本 步 骤 及 步 骤 1 7 和 1 8 的 操 作 ，应避免破坏易碎 细胞。 17. 用 2m l 的吸管将2m l 预 热 的洗液逐滴加入到P E G /混合细胞中， 2〜3m i n 内加完， 每一滴后轻柔混匀细胞（以获得小团细胞聚集物）。 18. 用 IOml的吸管将7m l 预热的洗涤培养基逐滴加入到前一步骤所得的溶液中，每次 加一滴， 2m i n 内加完，继续用吸管末端轻柔混匀细胞。 19. 室温， 800g•离心 5min。 20.用 IOml的吸管将IOml胸 腺 细 胞 悬 液 （来自步骤8 ) 用力加到细胞团块上。 21. 搅拌的同时继续加入剩余的胸腺细胞，直 到 达 到 所 需 的 体 积 （每 个 培 养 皿 IOmU 步 骤 8 和 13)，避免用力吹打。 22. 保 持 IOml吸 管 （不要用自动移液器）成 450角 ，用另一只手的手指固定住吸管末端 使之位于9 6 孔平底板孔上方l c m ，各 孔 加 入 两 滴 （约 0.1ml) 细胞悬液。 23. 将每块培养板用锡箔包裹（可选使用），置 于 37°C ， 7 . 5 % C 0 2 培养箱中。
    2 4 . 培 养 I d 后 ，用 IOml吸管每孔加入两滴2 X H A T 培养基，每块培养板用不同的吸 管 ，不能将每块培养板的盖子混淆。将培养板重新置于培养箱。 25. 融合后第3 天 ，当非融合细胞死亡而融合细胞尚未生长起来时，将细胞置于倒置显 微镜下观察。如果没有观察到大量细胞死亡，检 查 这 批 H A T 的 有 效 性 （保存于 4°C ，有效性会选择性降低）。或者，选择一株新的生长于l( T 4mol/L 6-硫鸟嘌呤的 B W 5147 细胞。 26. 在 第 6〜7 天 ，当杂交瘤细胞可见时，用无菌吸管吸弃每孔一半液体。每孔加入两 滴新鲜融化的2 X H A T 培养基。如果液体变黄，应在倒置显微镜下观察，确证不 是由污染引起，则开始扩增。 27. 从 第 6〜7 天开始，每天检查培养板中细胞是否需要扩增，即孔底细胞是否覆盖 5 0 % 。扩增液体轻微变黄的孔，用 I m l 吸管转移细胞到2 4 孔板中。每 孔 加 入 Iml I X H T 培养基。 2 8 . 扩增后的 1 〜2 d ， 室温补充Iml I X H T 培养基。 29•当2 4 孔板中的细胞生长状态良好，重悬每孔的细胞，吸 取 I m l 加入到另一块新的 2 4 孔板，每孔中补充Iml D M E M -10完全培养基，从而复制两块相同的培养板。 3 0•步骤2 9 之 后 的 1〜2 d 内，当孔中的杂交瘤细胞长到I X l O 6〜2 X 1 0 6 个 时 ，用其中 一块培养板进行筛选。在等待筛选结果时观察另一块培养板，根据需要确定是否需 要补充培养基，一旦孔中液体变黄，用 新 鲜 的 D M E M -10完全培养基替换孔内3/4 的液体。

    辅助方案 1 筛选表达 C D 3-T C R 原始杂交瘤

    在杂交瘤被转移到 2 4 孔 板 后 ，立 即 利 用 一 孔 进 行 初 筛（如 初 筛 C D 3-T C R 的表达）。被选择的细胞株应该通过有限稀释进行克隆和冻存（单 元 1 . 3 , 辅助方案）。

    附 加 材 料

    在杂交瘤被转移到2 4 孔 板 后 ，立 即 利 用 一 孔 进 行 初 筛 （如 初 筛 C D 3-T C R 的表 达）。被选择的细胞株应该通过有限稀释进行克隆和冻存（单 元 1 . 3 , 辅助方案）。 附 加 材 料 （其他材料见基本方案，带V 项 目 见 附 录 1) 生长中的 杂 交 瘤 （见基本方案，步 骤 30) V 洗涤缓冲液 异 硫 氰 酸 荧 光 素 （H T C ) 的 交 联 的 抗 鼠 C D 3-eMAb (Pharmingen H M -C D 3 ，表 2. 11. 1) F I T C 的交联的对照M A b (如 M A b 识别不表达在T 细胞上的抗原的任何抗体） 4ml 圆 底 离 心 管 （Falcon 或 Equivalent) 1 . 用 2m l 吸管重悬2 4 孔板中的一孔，并平均分配至两个4m l 的圆底管中。 2. 4°C ， 200g 离 心 5min，弃上清，每管中加入2m l 洗涤缓冲液并再次离心。 3 . 在其中一管中加入F I T C 标 记 的 抗 C D 3 抗 体 ，另 一 管 中 加 入 F I T C 标记的对照抗体 (依经验决定单克隆抗体的饱和量）（单 元 4.1和 单元4. 2 , 通 常 是 lMg/106 个细胞）， 在冰上孵育20〜30min。 4 . 每管中加入2m l 洗涤缓冲液， 离 心 ，弃上清，同步骤2 , 重复一次。 5 . 每管中加入0 . 5m l 洗涤缓冲液，进行流式细胞分析。确 认 抗 C D 3 抗体标记的杂交瘤 (如 表 达 C D 3-T C R ) 用于抗原识别的候选者。

    辅助方案 2 筛选抗原特异性的杂交瘤

    在辅助方案 1 中，只有一部分 C D 3-T C R + 的杂交瘤具有所需的抗原特异性，因此，需要测试候选杂交瘤的抗原特异性，而 不 是 保 存（克隆及冻存）所 有 的 C D 3-T C R + 的杂交瘤。

    附 加 材 料

    生 长 中 杂 交 瘤 （见基本方案，步 骤 30) 同基因型的脾细胞悬液（与 活 化 T 细胞供者同系小鼠；用于检测可溶性抗原的特 异性）或同种异体小鼠脾细胞悬液，即 与 M L C 中刺激细胞供者小鼠同系；用 以检测同种异体抗原的特异性（单 元 2.1) 可溶性蛋白或多肽抗原 la. 检测对可溶性蛋白抗原的特异性：对每一种被检测的杂交瘤，将 用 D M E M -10完全 培养基培养的同基因型脾细胞悬液0.1ml (2X 106 个细胞/ml) 加 入 9 6 孔平底板中 的 2 孔 或 6 孔以检测对可溶性抗原的特异性的杂交瘤（两孔用于杂交瘤本身，两孔 用于杂交瘤和脾脏细胞，两孔用于杂交瘤、脾脏和抗原）。 lb. 检测对同种异体抗原的特异性：对每一种被检测的杂交瘤，将 用 D M E M -10完全培 养基培养的同种异型脾细胞悬液0.1ml (2X 106 个细胞/ml) 加 入 9 6 孔平底板中的 4 孔 或 者 6 孔以检测对同种异体抗原的特异性的杂交瘤性（2 孔用于杂交瘤本身， 2 孔用于杂交瘤和同种异体脾脏细胞）。 2 . 如检测对可溶性蛋白抗原特异性的杂交瘤，向含有同基因型的脾细胞的两个孔中加 入适量抗原。 3 . 用 I m l 的吸管在2 4 孔板中的一个孔中重悬杂交瘤细胞（见基本方案，步 骤 30)，分 配 至 6 孔中 ，每 孔 0 . 1 m l 细 胞 悬 液 （I X l O s〜 2 X 106 个细胞），用于检测可溶性蛋白 特异性的克隆，或分配至4 孔 中 ，用于检测同种异体抗原特异性的克隆。 2 4 孔板中 剩下的细胞，补 充 D M E M -10培养基，进一步培养和监测。 4 . 把 9 6 孔板置于37°C ，培 养 18〜24h 。 5 . 从监测板的每孔中吸出100M1上清，置于一块新9 6 孔板中，作为原监测板的复板。 6 . 将该复板放置一20°C 冷冻应不少于lh。如果该板需冷冻保存数天，需用锡箱纸包裹。 7•将复板解冻后进行C T L 增 殖 检 测 （单 元 5.1)，以 监 测 孔 中 IL- 2 和 （或） IL- 4 的 含量。 对于可溶性抗原特异性的T 细胞：如果该杂交瘤表达所需的特异性抗原，仅在 同时含有抗原、脾细胞和杂交瘤细胞的孔中才能产生细胞因子。对于同种异型抗原 特 异 性 T 细胞：如果该杂交瘤表达所需的特异性抗原，仅在同时含有同种异型刺激 细胞和杂交瘤细胞的两孔中才能产生细胞因子。 8 . 将所需的杂交瘤细胞通过有限稀释法克隆并冷冻保存（单 元 1.3)。
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    来源：丁香实验

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