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磁 珠 法 分 离T 细 胞 和 B 细胞

相关实验：磁珠法分离 T 细胞和 B 细胞

最新修订时间：

材料与仪器

步骤

基 本 方 案 1 用 AUTOMACS 系 统 进行 总 T 细胞、 CD4 + 细 胞 或 CD8+T细胞的自动分离

材 料

小鼠

HBSS 洗涤缓冲液
VM ACS缓冲液 磁 珠 （表 2. 2.1; Miltenyi) VRPMI-IO完全培养基 autoMACS系 统 和 分 选 柱 （Miltenyi) 30/zm尼 龙 网 （BD) 或 40jum预 分 离 滤 膜 （Miltenyi) 表 2. 2 . 1 小 鼠 T 细胞群分离的磁珠选择 目的细胞 磁珠 总 T 细胞 CD90 (Thyl.2) CD4 + T 细胞 CD4 (L3T4) CD8 + T 细胞 CD8a (Ly-2) 1 . 用 5 只小鼠的淋巴结或2 只小鼠的脾脏制备单细胞悬液并去除红细胞（单 元 2.1)。 2 . 将细胞在IOml HBSS洗涤缓冲液中混悬后用血细胞计数器计数（附 录 3A)。 3 . 将细胞悬液在4°C ， 200g 离 心 lOmin。弃上清后将沉淀按每IO8 个 细 胞 0. 9ml MACS 缓冲液的比例混悬。每 IO8 个 细 胞 加 入 0.1m l适 当 的 磁 珠 （表 2.2. 1 ) 后 在 4°C孵 育 15min0 4•在孵育的时间里，打 开 autoMACS系统电源。按产品说明书中操作规程运行清洁 程序。 5 . 将细胞悬液在4°C ， 200g 离 心 lOmin。弃上清，在沉淀中加入足量的MACS缓冲液 使细胞浓度达到IO8 个细胞/ml，充分混悬。将 细 胞 通 过 30|urn尼 龙 网 或 40Mm 预分 离滤膜。用 0.1〜0.4ml MACS缓冲液冲洗滤网。 6 . 将细胞放到autoMACS的上样通道。选 择 possel程序 ，这样标记的细胞将从阳性通 道洗脱。 7 . 将细胞悬液在4°C ， 200g■离心10min。弃上清后将沉淀用2〜5mlRPMI-1 0 完全培养 基混悬。计 数 （附 录 3A )。

基 本 方 案 2 使 用 AUTOMACS 系 统 进 行 B 细胞的自动分选

材 料

小鼠

HBSS 洗涤缓冲液

MACS 缓冲液

CD45R (B2 2 0 ) 磁 珠（Miltenyi)

RPMI-10 完全培养基

autoMACS 系 统 和 分 选 柱（Miltenyi)

30um 尼 龙 网（BD) 或 40/xm 预 分 离 滤 膜（Miltenyi)

1 . 用 2 只小鼠的脾脏制备单细胞悬液并去除红细胞（单 元 2.1)。

2.将细胞在 10 ml HBSS 洗涤缓冲液中混悬后用血细胞计数器计数（附 录 3A)。

3.将细胞悬液在 4℃， 20og离心 10min。弃上清后将沉淀按每 108 个细胞 0.9ml MACS缓冲液的比例混悬。每 108 个细胞加入 0.1ml CD45R(B220) 磁珠后在 4℃孵育 15 min

4.按基本方案 1 中的步骤 4〜7 操作，这样 B 细胞将从阳性通道洗脱。

基 本 方 案 3 使 用 AUTOMACS 系统进行辅助细胞的自动分选

材 料
小鼠

HBSS 洗涤缓冲液

MACS 缓冲液

CD90 (Thyl.2 ) 磁 珠（Miltenyi)

RPMI-IO 完全培养基

autoMACS 系统和分选柱（Miltenyi)

30um 尼 龙 网（BD) 或 40um 预分离滤膜（Miltenyi)

1.用 2 只小鼠的脾脏制备单细胞悬液并去除红细胞（单元 2.1)。

2.将细胞在 IOml HBSS 洗涤缓冲液中混悬后用血细胞计数器计数（附录 3A)。

3.将细胞悬液在 4°C， 200 g 离心 lOmin。弃上清后将沉淀按每 IO8 个细胞 0. 9 mlMACS缓冲液的比例混悬。每 1 〇 8 个细胞加入0.1ml CD90 (Thy1.2) 磁珠后在 4℃孵育 15 min

4.除了选择 depletes 程 序（非 possel 程序），其他操作按基本方案 1 中的步骤 4〜7 进行，这样辅助细胞将从阴性通道洗脱。

备 选 方 案 1 用磁性分选柱手工操作分离淋巴细胞

附 加 材 料（其 他 材 料 见 基 本 方 案 1 )

不含气体的 MACS 缓冲液， 4°C (在上样和洗柱过程中保持冰冷）

Midi MACS 分离磁铁、 MACS 多用支架、 LS 或 LD 分 选 （Miltenyi)

15 ml 离心管，无菌

la. 对于分离总 T 细胞， CD4+ T 细胞或 CD8+ T 细胞：按前述方法制备并标记单细胞悬 液（见基本方案 1， 1〜3 步）。

lb. 对于分离 B 细胞：按前述方法制备并标记单细胞悬液（见基本方案 2 , 步骤 1〜3)。

lc. 对于分离辅助细胞：按前述方法制备并标记单细胞悬液（见基本方案 3 , 步骤1〜3

2.将细胞悬液在 4°C， 200 g 离心 lOmin。

3.离心期间，将 Midi MACS 分离磁铁安装到 MACS 多用支架上，并将 LS 分选柱（用于分离总 T 细胞、 CD4+T 细胞、 CD8+T 细胞或 B 细胞）或 LD 柱（用于分离辅助细胞）放到磁体中，在分选柱下放一支无菌的 15 ml 离心管。用 4°C 不含气体的 MACS缓冲液冲洗分选柱 3 次，每次 3 ml。弃洗脱液，在分选柱下方放置一支干净的无菌离心管。4 . 离心结束后弃上清，将 沉 淀 按 IO8 个细胞/m l的浓度用MACS缓冲液彻底混悬。将 细胞通过30/xm尼 龙 网 或 40/xm预 分 离 滤 膜 。用 0 •1 〜 0.4ml MACS缓冲液冲洗 滤网。 5 . 将细胞悬液上样到LS或 LD分选柱上。 6 . 用 MACS缓冲液每次3m l冲洗分离柱3 次 。第 一 个 3ml应缓慢加入以免扰动分选柱 中的细胞。如果需要，将洗脱液作为阴性细胞保存（如果分离辅助细胞，阴性细胞 中含有去除的T 细胞）。 7 . 从磁体上取下分选柱，放 在 一 个 干 净 的 无 菌 15m l离心管上。在 分 离 柱 中 加 入 5ml MACS缓冲液。将活塞塞进分离柱并洗脱阳性细胞，根据分选柱和标记抗体的不同 分为总丁细胞、 CD4 + 细胞、 CD8 + 细胞 或B 细 胞 （步 骤 1)。 8 . 将细胞悬液在4°C ， 200g 离 心 lOmin。弃上清后将沉淀用2〜5mlRPMI-10完全培养 基混悬。计 数 （附 录 3A)。

基 本 方 案 4 用 AUTOMACS 系统自动 分 选 CD4 +CD2 5+ 抑制性细胞

由此方法得到的阴性细胞（CD4+CD2 5- ) 可用作反应细胞或对照细胞。
材 料 （带V 项 目 见 附 录 1) 小鼠 V H B S S 洗涤缓冲液 V M A C S 缓冲液 C D 8a (Ly- 2 ) 磁 珠 （Mikenyi) V 结合缓冲液 biotin-抗 C D 25 (7D 4) (PharMingen) Streptavidin-PE (PharMingen) 抗 P E 磁 珠 （Miltenyi) 完 全 R P M I 培养基 小 鼠 CD3+ T 细胞富集柱和I X 纯 化 柱 缓 冲 液 （R&D Systems) 15ml离心管，无菌 30/xm尼 龙 网 （BD) 或 40/xm预 分 离 滤 膜 （Miltenyi) a u t o M A C S 系 统 和 分 选 柱 （Miltenyi) 1 . 用 2 0 只小鼠的淋巴结制备单细胞悬液并去除红细胞（单 元 2.1)。 2 . 将细胞在20ml HBSS洗涤缓冲液中混悬后用血细胞计数器计数（附 录 3A )。 3 . 将细胞悬液在4°C ， 200g 离 心 lOmin。离心过程中，准 备 3 支小鼠CD3 + T 细胞纯化 柱 ，按说明书的指导用I X 纯化柱缓冲液洗3 遍 。弃洗脱液，在每支纯化柱下方放置 一 支 15ml离心管。 4 . 用 3ml I X 纯化柱缓冲液和3ml HBSS洗涤缓冲液混悬细胞。将细胞通过30Mm 尼龙 网 或 40Mm 预分离滤膜后，每支纯化柱中加入2m l细胞。室温孵育15min。 5 . 用 2ml I X 纯化柱缓冲液洗涤纯化柱4 或 5 遍 以 洗 脱 T 细胞。用血细胞计数器计数 (附录 3 A ) 后 ，将细胞悬液在4°C ， 200g 离 心 lOmin。
6 . 将沉淀按每IO8 个细胞加〇 .9ml M A C S 缓冲液的比例混悬。每 IO8 个细胞加入 0 . 1 ml C D 8a (Ly- 2 ) 磁珠后在 4°C |浮育 15min。 7. 4°C ， 200g 离心 lOmin。 8 . 以 MACS缓冲液混悬细胞，使细胞浓度达到IO8 个细胞/ml。将细胞通过 3 0Mm 尼龙 网 或 40jttm预 分 离 滤 膜 。将 细 胞 放 到 autoMACS的上样通道。选 择 depletes程序 (CD4+ T 细胞将从阴性通道洗脱）。 9 . 回 收 细 胞 计 数 （附 录 3A)，在 4°C ， 200g 离 心 lOmin。 1 0 . 用结合缓冲液混悬细胞使其浓度达IO8 个细胞/m l 。 每 IO8 个细胞加入15哗1)丨〇如- 抗 CD25 (7D4)。 4〇C孵育 1 5min。 4°C ， 20Qg•离心 lOmin。 1 1 . 用结合缓冲液混悬细胞使其浓度达IO8 个细胞/m l 。 每 IO8 个细胞加入 7. 5/^g Streptavidin-P E 。 4 〇 C 孵育 1 5min。 12. 4°C ， 200g 离心 lOmin。 13. 用 MACS缓冲液混悬细胞使其浓度达IO8 个细胞/ml。每 IO8 个 细 胞 加 入 0. Im l抗 PE磁珠。 4°C孵 育 15min。 14. 4°C ， 200g 离心 lOmin。 这 种 三 步 标 记 方 案 是 一 种 被 广 泛 采 用 的 方 法 ， 具 有 重 复 性 好 、 回 收 细 胞 纯 度 高 的 特 点 。 但 是 ， 有 几 种 新 试 剂 能 将 操 作 减 少 到 两 步 。 与 抗 C D 2 5 抗 体 孵 育 后 ， 细 胞 可 被 链 霉 亲 和 素 磁 珠 （Miltenyi) 或 者 抗 生 物 素 磁 珠 （Miltenyi) 标 记 。 三 步 法 的 优 势 在 于 细 胞 被 荧 光 染 料 标 记 ， 分 离 后 的 细 胞 可 以 直 接 在 流 式 细 胞 仪 上 进 行 纯 度 分 析 (如 单 元 4 . 2 所 述 ）。 如 采 用 链 霉 亲 和 素 或 抗 生 物 素 磁 珠 ， 则 需 要 染 色 后 才 能 进 行 F A C S 分 析 。 另 一 种 选 择 是 将 细 胞 用 PharMingen公 司 生 产 的 P E 抗 C D 25 (P C 61) 标 记 后 ， 用 抗 P E 磁 珠 处 理 。 但 是 ， 研 究 人 员 应 该 知 道 P C 6 1 阻 断 IL-2 与 C D 2 5 的 结 合 ， 而 7D 4 克 隆 则 不 会 。 因 此 ，使 用 P C 6 1 时 应 仔 细 计 算 效 价 并 使 用 尽 可 能 少 的 量 ， 以 免 受 体 饱 和 而 影 响 细 胞 功 能 。 15. 用 MACS缓冲液混悬细胞使其浓度达IO8 个细胞/ml。将细胞放到autoMACS系统 的上样通道。选 择 posseld程 序 （CD4 + CD2 5 + 细 胞 将 由 阳 性 通 道 洗 脱 ， CD4+ CD25-细胞从阴性通道洗脱）。 16•将细胞在4°C ， 2 0 0g 离 心 10min。用 2m l完 全 RPMI培 养 基 混 悬 CD25+细胞。用 IOml完 全 RPMI培养基混悬C D 2 5 - 细胞并用血细胞计数器计数（附 录 3. A)。 为 了 保 养 仪 器 ， a u t o M A C S 可 用 一 个 柱 子 ， 用 possel_s程 序 纯 化 细 胞 。 纯 化 的 C D 2 5 + 细 胞 可 以 在 autoMACS (—^ 欠 冲 洗 后 ） 再 次 以 possel程 序 上 样 。

备 选 方 案 2 用磁性分选柱手工操作分离 CD4 +CD25+抑制性细胞

附 加 材 料（其 他 材 料 见 基 本 方 案 4)
不含气体的 MACS 缓冲液， 4°C (在上样和洗柱过程中保持冰冷）

Midi MACS 分 离 磁 铁（Miltenyi)

MACS 多 用 支 架（Miltenyi)

LD 分 选 柱（Miltenyi)
1 5m l 离 心 管 ，无 菌 LS 分 选 柱 （Miltenyi) I . 按前述方法制备单细胞悬液，纯 化 T 细 胞 并 加 入CD8a (Ly- 2 ) 磁 珠 （见基本方案 4 ，步 骤 1〜7)。 2•将Midi MACS分离磁铁安装到MACS多用支架上，并 将 LD分选柱放到磁体中，每 次 用 3m l4°C不含气体的MACS缓冲液冲洗分选柱共3 次 。弃 洗 脱 液 ，在分选柱下 方放置一支新的无菌15ml离心管。 3 . 离心结束后弃上清，将 沉 淀 用 IO8 个细胞/m l的 MACS缓冲液彻底混悬。将细胞通 过 3〇 ium尼龙网或40|um预分离滤膜。用 0. 1〜0. 4ml MACS缓冲液冲洗滤网。 4 . 将细胞悬液上样到LD分选柱上。 5 . 用 MACS缓冲液冲洗分离柱每次3ml，共 3 次 。第 一 个 3m l应缓慢加入以免扰动分 选柱中的细胞。将洗脱液作为阴性细胞（CD4 + 细胞）保存。 6 . 将细胞悬液在4°C ， 200g 离 心 lOmin。 7 . 按前述方法用结合缓冲液混悬细胞后加入biotin-抗 CD25、 Streptavidin-PE，以及抗 PE 磁 珠 （见基本方案4 ，步 骤 10〜14)。 8 . 用 MACS缓冲液混悬细胞使其浓度达IO8 个细胞/m l 。 9 . 将 一 支 L S 分选柱放在Midi M A C S 分离磁铁上，用 M A C S 缓 冲 液 每 次 3m l 洗 3 遍 L S 柱 。弃洗脱液，在分选柱下方放置一支新的1 5m l 离心管。 10. 离 心 结 束 后 弃 上 清 ，将 沉 淀 用 M A C S 缓 冲 液 彻 底 混 悬 使 细 胞 浓 度 达 IO8 个细 胞/m l 0 II. 将细胞通过30Mm 尼 龙 网 或 40Mm 预分离滤膜。用 0.1〜0.4ml MACS缓冲液冲洗 滤网。 12. 将细胞悬液加到LS柱中。 13. 用 MACS缓冲液冲洗分离柱每次3ml，共 3 次 。第 一 个 3ml应缓慢加入以免扰动分 选柱中的细胞。将洗脱液作为阴性细胞（CD4 +CD25-细胞）保存。 14. 将分选柱从磁铁上取下。在分离柱中加入5ml MACS缓冲液。将活塞塞进分离柱并 洗 脱 阳 性 细 胞 （CD4+CD25+细胞）。 15. 将细胞在4°C ， 200g 离 心 lOmin。将 CD25+细 胞 用 1〜2mlRPMI完全培养基混悬。 将 CD25— 细 胞 用 IOml RPMI完全培养基混悬。计 数 （附 录 3A)

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来源：丁香实验

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