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    免 疫 球 蛋 白 M(IgM)和 免 疫 球 蛋 白 D(IgD) 的纯化实验

    最新修订时间：

    材料与仪器

    步骤

    备 选 方 案 1 硫 酸 铵 沉 淀 法 纯 化 IgM

    此法适用于多数 IgM 抗体，尤其是一些在水中不能形成沉淀的 IgM 抗体。
    附 加 材 料（其 他 材 料 见 基 本 方 案 1 )

    饱和硫酸铵（SAS)

    硫酸铵结晶（CAS)

    硼酸缓冲液，可选
    玻 璃 棉 （ Polyscience) Ia•适用于腹水：为了清除腹水中的脂类物质，将足够玻璃棉置于漏斗中盖住漏斗口， 倒人腹水，再用PBS冲洗玻璃棉，并戴好手套轻轻挤压玻璃棉，收集全部滤出液， 将滤出液于4°C或室温，20 OOOg离 心 30min, 轻轻倒出上清，弃去沉淀。边搅拌边 缓慢在上清中加入SAS至终浓度4 5% (V/V) , 在 4°C静 置 1〜2h 或过夜，使所有 蛋白质沉淀。 Ib. 适用于MAb上清：将 MAb上清于4°C或室温，20 OOOg离 心 30min，轻轻倒出上 清液，在上清液中加人下列量的CAS: CAS (g) = (0.45 倍上清液体积）X76/100 2•将沉淀于4°C或室温，20 OOOg离 心 lh。保留上清，测其活性。用最少量PBS或硼酸 缓 冲 液 （ 10〜20ml) 溶解沉淀并转至透析袋中，用> 2 0 倍体积的PBS或硼酸缓冲液 于 4°C透析24〜48h, 在透析过程中更换透析缓冲液4〜6 次，透析完成后，将溶液 浓缩至< 5 ml (CPI附录3H)。 3 . 用 SE层析柱纯化IgM后分析保存（ 见基本方案1，步骤3〜5

    备 选 方 案 2 甘 露 聚 糖 结 合 蛋 白 亲 和 纯 化 IgM
    甘露聚糖结合蛋白（ MBP) 可亲和纯化人和小鼠IgM，此法也适用于其他物种的 纯化。 加 材 料 （ 其 他 材 料 见 基 本 方 案 1 ，带V 项 目 见 附 录 1) EDTA lmol/L NaOH 腹水或单克隆抗体（ MAb上清）（ 单 元 1.4) 超连接固定的甘露聚糖结合蛋白（ MBP; Pierce) 结合缓冲液：〇• lmol/L NaOH/O .5mol/L NaCl, PH8. 3 分别于4°C和室温保存 I.Omol/L碘化钾 PBS L 5cmXIOcm层析柱或50ml离心管 MSE Mistral 3OOOi冷冻离心机（ 或类似设备，仅供批量纯化使用） ，4°C或室温 在腹水或MAb上清中加入EDTA至终浓度10mmol/L, 用 NaOH调 pH至 8. 0。 IgM 层析纯化 将超连接固定的MBP溶于结合缓冲液中，填 入 1.5cmXl〇Cm层析柱，在 4°C下用 20ml结合缓冲液洗柱。注意：要在低温情况下结合IgM。在 4°C下将腹水或MAb 上清上样并保留15min。柱子的结合力约为lmg IgM/ml固定的MBP。 在 4°C下用结合缓冲液洗柱，将结合有IgM 的层析柱移至室温并在室温下放置lh» 让柱子自然流出缓冲液，收集流出液，每组分收集lml，收集20〜5 0 组分。将室温 的结合缓冲液不断从层析柱顶部加人，防止层析柱流干。监测A28。值 （ 表 1.5. 1)， 用 SDS-PAGE鉴 定 组 分 （ 单 元 12.3)。
    5a. 用一个柱体积的l .Omol/L 捵化钾洗脱残留在层析柱上的IgM , 并与先前收集的组 分合并，用 ELISA检测抗体活性（ 单 元 1.1)。 IgM 批量纯化 2b. 将 5〜IOml超连接固定的MBP倒 人 50ml离心管中，加人结合缓冲液至4〇 ml， 4T； ， 1200g 离 心 IOmin, 留下约2ml上清，其余弃之。在 MBP中加入腹水上清或 M A b 上清，混匀，于 4°C下静 置15m in， 在低温条件下结合IgM， MBP的结合力 约为Img IgM/ml固定的MBP。 3b.4°C下用结合缓冲液洗IgM-MBP混合液，4°C ，1200g 离 心 I0min，倒掉上清，使基 质中留有最少体积的结合缓冲液，在室温下静置约lh。 4b. 1200g■离心IOmin, 收集上清，在 沉 淀 中 加 入 1 倍 柱 体 积 的 i.0m〇] y L 碘化钾， 1200g 离 心 lO m in，收集上清，将二次上清合并。 MBP可以反复使用1 0 次。循环使用前必须去除破化钾，然后用结 合 缓 冲 液 重 新平衡。 6•将上清用P B S 透 析 （ C P I 附 录 3H )，以 1〜20mg/m l溶 于 P B S 中，保 存 于 4。(：或 —70

    备 选 方 案 3 IgM 纯化试剂盒
    可从Pierce或 Pharm acia购买商品化试剂盒并按生产商指导使用。 AbZorb试剂盒 (Pierce) 包含足够的吸收剂和缓冲液，可纯化小鼠血清或腹水来源的]_ 〇mgigM。 E-ZSEP试 剂 盒 （ Pharmacia)'可纯化澄清腹水、生物反应器培养上清、组织培养上清或血 清中IgM。这些试剂盒的使用请按照说明书进行。

    本 方 案 2 凝 集 素 亲 和 层 析 法 纯 化 小 鼠 IgD
    小鼠血清中的Ig D 浓度非常低（< ljug/m l)，因此，通常从浆细胞瘤和杂交瘤中获 取毫克数量级的 IgD 。来源于 GW//o n ia «'»jW fci/oZia-l (GS-I , 以前称为 的 a-吡喃乳糖结合凝集素与小鼠Ig D 特异、可逆结合，其他型小鼠Ig 不能与此凝集素结合。 丄 材 料 （ 带V 项 目 见 附 录 1) 荷载产生IgD的小鼠浆细胞瘤（ 如 TEPC-1017)、分 泌 IgD 的 杂 交 瘤 （ 如 B18_s) 或 含 M A b的培养上清 P B S -C A :含 lm m ol/L C aC l2 & P B S ， pH7. O ( 冷藏 ） 脱 脂 （ D elipidating)试 剂 （ B eckm an)或见单兀 1. 5 G S-I凝 集 素 交 联 琼 脂 糖 凝 胶 （ E-Y labs) PBS-C A -G A L :含 0. lm o l/L 1>半乳糖的 PBS-C A ， PH7. 6 (脅藏) ■\/PBS， pH7. 3，冷藏 Sorvall离心机， SS-34型 转 子 （ 或类似转子） ， 4°C 1〜50m l层析柱

    1.从含浆细胞瘤或杂交瘤的小鼠中收集IgD腹 水 （ 单 元 L 4 中基本方案2 ，步 骤 1〜 9)。尽量使用新鲜收集的腹水，不能冻融。对 于 MAb培养上清，4。0 ，20 OOOg离心 30min, 弃去细胞沉淀，保留上清。 2 . 在腹水中加入9 倍体积的预冷PBS-CA缓冲液，4X； ，20 OOOg 离 心 30min，收集上 清并按使用说明加人脱脂试剂或使用单元1.5方 案 （ 见基本方案丨，步 骤 la), 收集 水相。对 于 MAb培养上清，用 PBS-CA缓冲液按1:1〇稀释。 3•在4°C冷室里，准备1〜5ml GS-I凝集素交联琼脂糖凝胶层析柱（C P I 附 录 31) , 并 分别用10个柱体积的下述预冷缓冲液按顺序洗柱： PBS-CA、 PBS-CA-GAL、 PBS-CA。 4 . 将腹水或MAb上清上柱，流速为< lml/min [约 0.5ml/ (min . cm— 2)]， 以后步骤 中都用此流速。 凭经验确定样品和层析柱的最佳结合比例，先试用2 : 1 的比例。在预试验中可 以用ELISA法测定流出液（ 单元1.1)，以确定层析柱的结合力是否已达到饱和。 5•用预冷的PBS-CA缓冲液洗柱，监测流穿组分和接下来的洗出液的A28。值，直到 A2 m回到基线，若 A2 m不能快速回到基线，则表明层析柱有可能超载。 6 . 用预冷的I3BS-CA-GAL缓冲液洗脱IgD，确定洗脱体积，监测洗脱物质的吸收值， 直到A28。回到基线。通常，需 要 2〜5 倍柱体积的PBS-CA-GAL洗脱液。 7. 洗脱下的样品于4°C对 IL 预冷的PBS (pH7 . 3 ) 进 行 透 析 （ CPI附 录 3H)，期间更 换透析液3 次。 8 . 测 值 ，确定IgD浓度。用 10%SDS还原聚丙烯酰胺凝胶电泳判断IgD纯 度 （ 单 元 12. 3)，用 PBS配成浓度为^ lmg/rnl的 IgD于一70X：保 存 （ 不要冻融） 。 9•用1 倍柱体积的预冷PBS-CA-GAL缓冲液洗柱，接着用1 0 倍柱体积的PBS-CA缓 冲液洗柱以再生柱子。用 含 0.02% NaN3 WPBS-CA缓冲液保存柱子，4。(：下可保存 1 年 （ 超过这个时间柱子的结合力减弱5 0 % 左右） 。再次使用前请按步骤3 重新平衡 柱子。
     

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    来源：丁香实验

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