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间 接 细 胞ELISA 法检测抗细胞表面抗原的特异性抗体

最新修订时间:

材料与仪器

步骤

本检测方法可用来筛选细胞表面抗原的特异性抗体(图 I.L 6)。

注意:所有步骤必须在 4°C 、含 有 NaN3 的生理缓冲液中进行。
图 I.1. 6 间接细胞ELISA法检测细胞表面抗原的特异性抗体。 Ab,抗体; C,细胞; E,酶

附 加 材 料(其他材料见基本方案,带 V 项 目 见 附 录 1)

未混合的细胞样品

碱性磷酸酶标记抗体或 F (ab’)2 (从免疫动物中获得的抗免疫球蛋白抗体)

阳 性 对 照 抗 体(即与实验细胞反应的从免疫动物中获得的抗体)

阴 性 对 照 抗 体(即不与实验细胞反应的抗体)

冰冷的洗涤缓冲液

锥底或圆底微量滴定板
1 . 用阳性和阴性对照抗体替换待测抗体,全细胞替换包被液,十字交叉连续稀释分析 法确定每孔需添加的最适细胞数和碱性磷酸酶标记抗体或F Ub^ 2 的 浓 度 (见辅助 方案)。初始滴定时每孔加入IXlO5〜5 X 105 个细胞、 0. 1〜10Mg/m l阳性和阴性对 照抗体、 0.1〜l 〇Mg/ml酶标抗体。 预试验中仅加入底物孵育,检测待测细胞本身是否表达碱性磷酸酶。如果表达 量较大,影响酶标抗体的检测敏感性,则用另一种酶标记复合物,如 P -半乳糖苷酶。 2 . 使用台式离心机,将细胞样品加入15m l或 50m l离心管, 4°C , 450g 离 心 5min。计 数 细 胞 量 (附 录 3A),并用冰冷的洗涤缓冲液重新将细胞混勻,配 制 成 IX IO6〜5 X IO6 个细胞/ml。 3 . 将 IOOju I 细 胞 悬 液 (I Xl O5〜 5 X 105 个 细 胞 )加 入 锥 底 或 圆 底 微 量 滴 定 板 孔 中 , 4°C , 450g 离 心 lmin。真空吸去上清液,微量滴定板置于振荡器或微量滴定板摇床 上 ,悬浮沉淀物。 4. 用 IOOjuI待测抗体或对照抗体(1〜10/xg/ml),在冰冷的洗涤缓冲液中重新混匀沉淀 物。 4°C 下孵育1.5h ,每 隔 15m i n 柔和摇动微量板重新混匀细胞。注意不要使细胞 悬液溅出孔板。 5. 4°C , 450g■离心细胞Imin,真空吸去上清液,振荡悬浮沉淀物,加 入 200jul冰冷的 洗涤缓冲液重新将其混匀,重 复 2 次 。 6 . 取 IOOmI 酶标抗体或酶标F (ab')2 (细胞表达Fc受体时用),用冰冷的洗涤缓冲液 稀释到最适抗体浓度(通常是1〇〇 〜500ng/ml) 重新混匀沉淀物。 4°C下 孵 育 1.5h, 每 隔 15min柔和摇动微量滴定板重新使细胞混勻。 7. 按步骤5 洗涤细胞,重 复 3 次。 8 . 加 入 100M1 MUP或 NPP底物溶液,进行显色,直至信号达到预想水平;显色过程 中,每 隔 15min柔和摇动微量滴定板重新使细胞混匀。如需要,加 入 25jul0.5mol/L NaOH终止显色。目测或用分光光度计定量检测确定显色程度(见基本方案,步 骤 9)。

来源:丁香实验

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