材料

步骤

一、示踪剂胞内注射用微电极管的准备

1.玻璃管的清洗。在耐热玻璃桶中把 200 g 重铬酸盐钾溶解在 IL 蒸馏水中，然后再向其中加入 750 ml 浓硫酸，用此来液清’洗玻璃器具。

2.把微玻璃管拉制成实验所需（根据要研究的神经元的大小和他们距电极进入点的距离）的长度和尖端构造。这也同样决定了玻璃电极种类的选取。例如，如果注 射用微管需要穿过比较长的距离时（超过 4~5 h), 就需要用长一点（超过 15 mm) 的 2-4 mmOD 玻璃管（comingglass) 来拉制，止其弯曲。

3.示踪剂的准备（用 0.5mol/LKCl 和 0_lmol/LTris 缓冲液，pH7.4，配置 10% 的 BoehringerHRP 液或 5%Sigma 生物素液）

4.灌注微玻璃电极管。微注射针呈 n 形圆点或三角形的非金属注射针（wpi) 应该正好能够填充入微玻璃电极管内。可以用更小的微玻璃电极管以后压填充法灌注的没有细丝的吸液管也用 0.81m 并且要防 mOD 玻璃管（50% 管壁厚度，FredericksDimmock 公司）拉制。

5.储存填充好了的微玻璃管于湿润的容器中。

6.用电抛光仪使微管尖端的直径小于 Imm(阻抗 40~80MΩ)。这样，我们能够得到和使用与 Sutter Instruments BV-IO 相一致的结果，当然其他方法也可以。

二、胞体内不輝剂的注射

1.穿刺细胞前面已经介绍过。在该过程中，能够在示波器上见到 10?80mV 的直流改变以及 10~50mV 的动作电位出现或/和电刺激有关的突触反应表明电极穿刺入细胞内。

2.等待直至记录稳定，必要时也可以注入小的（nA 级）超极化电流.

3.记录和区分逆行刺激反应和顺行突触反应。

4.通过给予 3~30 min 的 10~30nA 去极化电脉冲注入 HRP，同时监测诱发电位。

5 最后一次注入示踪剂后，让动物存活 4~l0 h，注意维持其正常血压、人工呼吸和麻醉。

三、轴突内示踪剂的注射

1.轻轻敲击电极固定器直至穿刺轴突纤维。成功穿刺会出现 l 〇~8 〇 mV 的直流改变以及 10~50mV 的动作电位。

2.记录和区分与行为相关的纤维发放模式。

3.通过给予 7~18 min 的 7~15nA(波宽 500ms,IHz) 去极化电脉冲注入 HRP，同时检测静息膜电位和单位放电模式。

4.最后一次注入示踪剂后，把动物放回饲养笼饲养 30—50 h。

四、处死麻醉、心脏灌流、组织固定、脑切片、免疫组织化学检测注射的示踪剂

1.用戊巴比妥钠深度麻醉动物后，等待其对强刺激的反应完全消失。

2.暴露股静脉并注射肝素抗凝（5000U，静脉注射)。

3.等待 30 min

4.切断胸骨打开胸腔，使胸腔开口尽可能大，结扎降主动脉（通常用止血钳夹住)，并在心尖上开一个小口，插入灌流管，在左心室和升主动脉上固定灌流管。

5.1L PBS(pH7.4) 用于心脏灌流清洗血液（恒河猴子和猫用 1L; 松鼠猴用 500 ml)。开始灌流时，向 PBS 中注入 Iml 亚硝酸钠或硝普钠，并在右心房开一切口。直到静脉血回流变清才停止 PBS 灌流（IOmin 左右)。

6.继续用 2L(猫或恒河猴；松鼠猴用 1L) 固定液灌流最初的 200 ml 固定液应该在较高的压力下进行灌流（可通过一个大体积的玻璃注射器或者在瓶中加压，用气压计检测维持在约 IOOkPa)。

7.用大约 IL 含 15% 蔗糖的固定液灌流心脏后结束灌流，0.5L 固定液对于重 Ikg 的动物（如松鼠猴）来说已经足够了。

8.在原位按立体坐标以最合适的三个切面（矢状、冠状及水平面）将脑分成块状，同时需要鉴定电极穿刺的踪迹、被注射细胞的位置以及它们的末梢区域。

9.解剖脑和/或脊髓组织。

10.把组织存放于冷的 20% 蔗糖（lm 〇 l/L 的磷酸缓冲液）中，组织化学检测以前一直放置在冰箱中保存，直到组织沉入瓶底方可开始组织学实验。

11.把组织放置在薄片切片机的基座上，用冷冻至冰点的含 20% 蔗糖的磷酸盐缓冲液（O.lmol/L,pH7.4) 浸没组织块，冷冻并切成 60 mm(生物素）或 80 mm(HRP) 厚的薄片。

12.在冷的 0.1mol/L 磷酸缓冲液（HRP) 或 PBS(生物素）中收集切片。

五、HRP 操作程序

六、生物素操作程序

结果

由于胞内示踪剂显色含有突触反应、神经元的放电模式、树突的形状和轴突的末梢等信息，这种技术被广泛用于研究脑内微回路。这里我们描述在这种技术帮助下所 发现和详细研究的两种细胞。我们之所以选择这些细胞类型，是因为这些细胞显著的形态学特征和哺乳动物中枢神经系统的重要功能相关。

麻醉猫中已经功能鉴定了视电层细胞内注射 HRP

图 5-15 显示的是视皮层第 5 层复杂的锥体细胞轴突末梢的分布，这是 Gilbert 和 Wiesel(1983) 通过向麻醉猫胞内注射 HRP，切片染色后重组得到的结果。从图上看, 这种细胞向第 6 层有很多投射，也有从下行长达 4 mm(离胞体）投射到 17 区中部的纤维。突触的这种投射能够解释第 6 层细胞特异的感觉野特性—能够叠加光栅的长度到相当大。第 6 层细胞的反应需要第 5 层细胞的投射得到了进一步的证实。Bolz 发现，当第 5 层细胞的活性降低时（通过微管注射 GABA)，第 6 层细胞对长光栅的反应性降低，而对短光栅的反应性没有改变。在器官水平上，这种投射特征代表了一种机制，这种『制能够解释对视野里明显分离的部分之间进行 整合的知觉现象。这种现象的一个例子可以通过 Craik-OBrien-Cornsweet 错觉得到，如图 5-15 上方的插图，尽管插图下方显示了各部分的亮度特征，中间的灰色区看起来还是要比两边的区域要暗一些（如果用细条把在亮度特征曲线所显示的灰色区域不连续部 分覆盖，这种错觉就消失了)。

在麻醉猫上观察已用轴突内注射 HRP 进行过生理鉴定的 a 型纤维和已用胞内注射 HRP 进行过功能鉴定的神经元之间形成的连接麻醉猫中生理上已经鉴定的^纤维轴突内注射 HRP 和功能上已经鉴定的踝伸肌 a 运动神经元胞体内注射 HRP 显示了纤维和神经元之间的突触联系，肌梭与初级传入的? 运动神经元的单突触兴奋性连接承担了很多的牵张反射，这当然是中枢神经系统中值得详细研究的内容之一。然而，复合兴奋性突触后电位（EPSP) 在很大程度上被认为和 Ja 纤维和 a 运动神经元之间突触的密度和运动神经元树突的位置相关，直到同时标记突触前和突触后的结构成为可能的时候我们才能得到确定的解释。图 5-16 显示了单块比目鱼肌 Ja 纤维和单个 S 类型 a 运动神经元之间立体联系的绘图。为了得到这些数据，Burke 等（1996) 在猫脊髓背部穿刺初级传入纤维（通过对电刺激单个肌神经的反应潜伏期短以及对低幅度高频率正弦性肌牵张产生反应的特性来确定它们)，然后向这些纤维里注射 HRP。接下来的 4?6 h 里不要惊扰动物，以保证 HRP 弥散到脊柱内的侧突部位，a 运动神经元也被穿刺并注射了 HRP。灌流后切片，组织化学方法处理切片以显示 HRP，通过切片重组传入纤维和运动神经元，凡是两者相联系的地方就被在欧几里得几何空间里打上点。接着，被注射的运动神经元的分离部分用别的方法重构。 考虑到支配每个运动神经元的^传入纤维的数量、两者之间的突触数量和由此产生的瞬时电导以后，典型的运动神经元的突触反应就有了幅度和时间上的特性（图 5-16)，这也就是实验中观察到的合群体 EPSPs。