方案3 尖电极细胞内记录

一、玻璃微电极的制备

1.玻璃微电极特性

已充灌好电解液（盐溶液）的玻璃微电极应具备下列特性：

在组织内移动、找寻靶细胞和细胞穿刺，微电极所致的组织损伤一定要小。因此，电极尖端应呈针状，可减小刺破细胞膜时的损伤；其次，当电极在组织内最深处时，电极外形应保证组织的位移小，导致组织表面的损伤小。

噪声水平应尽量小，以提高所记录信号的信噪比。存在于微电极和记录系统本身的口呆尸 1 问题以及降噪方法可见其他文献（Purves1981，Halliwelletal.1994,Benndorf1995)。充灌好电解液的玻璃微电极所产生的噪声，与玻璃成分、尖端直径、电解液类型、细胞内注射的物质种类有关。RC 噪声将随着电极穿刺组织的深度而提高（Benndorf1995)。通过拉制电极使电极尖端成一定的锥度，可降低电极尖端电阻。通过在微电极的尖端外表面涂上疏水树脂 Sylgard 层（距尖端 50—)，也可降低 RC 阻抗。

细胞内记录期间，电极电阻应保持稳定。实验期间，通过注射电流脉冲的方法进行电极电阻值监测。

电极尖端电压（接触电位）应尽可能地保持最小。液界接触电位存在于微电极尖端部位。胞内记录放大器的直流补偿功能可以调节以达到液界接触电位的调零。

电极应能通过较大的电流，但噪声和整流（电容带来的电流反弹）不应过大。

通过电流后的电极应具备快速复原的能力。

电流通过的能力以及快速复原的能力对于非连续性的单电极电压钳实验（dSEVC) 特别重要。将电极涂上干燥剂和凡士林，以便增强电极在这方面的特性（JnusolaetaL1997) 〇

2.选择微电极的玻璃管

制作微电极的玻璃管的材料通常是硅硼玻璃、含铅硅玻璃或石英三种。Quartz 拉制出的电极，具低噪声、质坚和使用持久等特点因此，电极在穿过硬脑膜过程中，尖端不会断裂。此类电极拉制需要利用激光软化石英进行。但是电极尖端很难断开，并且很难拉制出具有较大锥度的电极以便降低电极电阻。常用的硅硼玻璃，同软性玻璃相比，其硬度、持久性以及电极电阻系数方面更优越。利用合适的电极拉制器，制造出符合要求的不同长度、夕卜形和尖端特征的电极是比较容易的。至于含铅硅玻璃，它比硅硼玻璃在质上更硬，使用持久性更好些；此外，它也有较低的热膨胀系数和较小的点到值。此外，含铅硅玻璃在拉制成电极尖端的地方变薄，可拉制出较大锥度的精细电极尖端。

玻璃管的选择也依赖于玻璃管壁厚度、内径和外径及其内部结构（如有助于充灌的细丝或隔板夂我们倾向于使用相对厚壁的硅硼玻璃管，如 1.5x 〇.86(外径 X 内径）（ClarkElectromedicallnstruments,UK)。利用此种材料，较易拉制出长度、外形以及尖端电阻等不同的微电极。此种类型的玻管适合制作长及纤细的尖电极。并且, 它持久耐用和不易弯曲。因此，适合在脑组织深部进行细胞内记录。

3.选择电极拉制仪

除了大细胞外，其他细胞的胞内记录用水平拉制仪拉制电极的效果最好。此种拉制仪，采用二步拉制方法，可编程控制加热值和其他拉制参数。应该说，7]C 平拉制仪比垂直拉制仪具有更大的灵活性，更易拉制出合乎要求的具有一定长度、外形和尖端直径的微电极。性能优越的水平拉制仪是 Brown-Flaming 类型和 Zeiss 类型（DMZeiss,Germany) 等。

4.选择微电极的充灌液

充灌液通常采用钾盐溶液如下。

3mol/LKCl 溶液：在尖端直径一定的情况下，KCl 产生最小的尖端阻抗。因此，电压钳实验中常用此溶液。而且，充灌时，液体在电极尖端处扩散较迅速，并且形成气泡的可能性较小。其局限性在于 KCl 与细胞质的透析将会依赖 IPSP 反转氯离子。

3~5mol/L 醋酸钾溶液：此溶液不会导致氯离子依赖 IPSP 反转。但电极电阻会比较高。因此，经过电流脉冲后电极存在较长的复原时间。电极也趋向于产生整流（电流后的反弹)。

3mol/L 梓檬酸钾：此溶液相对黏滞性比较大，因此，电极液充灌起来有点困难。

然而，电流通过量比较髙；伴随电流脉冲过后，电极复原比较快。

2mol/L 甲基磺酸钾溶液：充灌此溶液的电极，其电流通过量最强、电极复原迅速、整流效应比较小。并且，在长时间记录期内，尖端阻抗能保持相对稳定。据报道 (ZhangetaL1994)，此溶液对细胞内结构和钙稳态平衡的破坏最小。对超极化后电位和电流影响也较小。因此，用负电流钳制使电位比静息膜电位更负时选取此类型的充灌液是比较好的。

5 mmol/L 或 10 mmd/LBAPTA 溶液：可加入到以上所述的任何溶液当中，BAPTA 可在穿刺时进入细胞内（已进入细胞或伴随电极穿刺时释放的 Ca2+缓冲液)。此外，BAPTA 似乎能提高电极与细胞膜的封接性，因此可改善记录质量。

5.充灌微电极

充灌液首先需通过标准的滤膜过滤，然后储存在冰箱中，待以后使用。实验当天，充灌液通过装置有 0. 针头滤器的微注射器，将溶液通过毛细管针直接注射入电极，微电极在充灌时要保持垂直。注射前电极液应充满在毛细针的尖端。充灌好的微电极尖端应 fe 证无气泡存在。气泡的存在将增加噪声和阻挡电流信号的通过。利用猫胡须（先用 70% 的乙醇浸泡过）接近尖端且旋转，可消除气泡。另外，也可将已充灌好的电极垂直放置，尖端朝下，放在一个较湿润的盒子内几分钟，使得气泡能慢慢地从尖端迁移到液体表面。

6.微电极与记录放大器的连接

微电极和记录放大器的连接必须采用不可极化的电极，通常是银/氯化银丝。要达到最好的结果，银/氯化银丝在使用前现准备，但这并不是绝对必需的。如果银/氯化银丝在几天前准备好，银/氯化银丝最好贮存在黑暗处，以避免氯化银的氧化。. 要得到银/氯化银电极丝，可通过将一根银丝连接于 9V 电池的正极，它的另一端浸入 lmol/L 氯化氢溶液；电池的负极则与另一根直径较大的银丝相连，放置于此溶液当中。几秒钟后，可见银丝表面会形成白色的氯化银，在另一根银丝上出现氧的气泡。表面镀好氯化银的银丝随后被插入玻璃微电极当中。但需要注意，管内电极液的高度不能超出镀了氯化银的银丝高度。玻璃微电极内可利用蜡或快千水泥处理固定银丝。氯化银电极的另一端银则通过一根短的有 BNC 接头的电缆（长 150 mm 或更小）和夹子与前置放大器相连。

当然，也可从 WorldPrecisionInstruments，USA 公司直接购买银/氯化银电极和固定玻璃微电极用的 O 形圈。所购买到的氯化银球头型电极，它是光稳定的，可以传递比普通银/氯化银电极丝更大的电流。不过，此种电极的缺点，在于他们使得前置放大器，与实验样品靠得太近，这也许就是限制区域的缺点。球型银/氯化银银丝也可用于动物接地。

二、神经元细胞内记录

定位、找神经细胞的方法可见先前的描述，在此所要阐述的是在微电极已进入脑内或脊神经节后相关的操作方法。

1.靠近神经细胞

神经细胞找寻时，放大器常置于桥式模式下。要取得穿刺实验的成功，玻璃微电极的尖端必须没有组织碎屑。脏的电极尖端将增加电极电阻（_re)，电极噪声也将随之而增加。通常使用两种方法来检查电极阻抗。一是观察给予电极负向直流电流（持续 50~1(%S) 后所出现的相应电压；二是直接在放大器上读取_re 的值。此外，在准备进行穿刺神经细胞之前，先给电极尖端清理电流以清洁电极尖端。

找细胞及穿刺细胞等操作最好使用高质量的微操纵器进行。微电极开始以低速度、连续方式，步进到所要找的神经细胞群区。然后，再改换成单步步进方式进行细胞穿刺。步进大小在 l~5/xm 之间。然而，靠近细胞时并没有固定的步进距离要求。最好的一次步进距离是由个人经验决定的，因为动物年龄、不同种、不同细胞、神经细胞大小、神经突起的分枝和组织本身等诸多条件均能影响到此操作。

2.穿刺神经细胞

活体动物中穿刺神经细胞的方法通常有两种。第一种方法，在利用微操进行穿刺细胞的同时，手动控制在电极尖端施加一正向清理电流（约 IOOnA)。某些放大器就具备此手动装置以辅助细胞穿刺。我们的经验是，借助此装置对于细胞穿刺比较有效。第二种方法，当电极以一个步进方式穿刺细胞时，可产生一短暂的电流振荡，从而对电极电容进行短暂的过度补偿。许多放大器都配有此种振荡电路。

成功的穿刺细胞的指标就是记录到负的稳定的膜电位（-50mV 或更负），此时，细胞没有发放动作电位或产生突触后膜电位（PSPs)。有时，为了提高细胞膜与电极间封接效果，需要电极前进或后退 0.5fzm。其他的判定指标包括波形较好的快速去极化、随后超极化和复极化的动作电位和典型的 PSPs。

三、记录模式

细胞成功穿刺后，神经细胞通常以三种模式被记录：桥式记录模式、非连续性单电极电流钳（dSECC)、非连续性单电极电压钳（dSEVC)。三种方法的共同点在于，都需要补偿各种由组织或记录系统导致的电极电容。可通过放大器上的电容补偿来实现补偿。

双电极电压钳技术（配有快速场效应晶体管控制的开关电路）在分析活体脊髓运动神经细胞的电信号中是非常有用的。此种方法在此不再描述，有兴趣的读者可参见文献。

1.桥式记录模式

桥式记录（bridge) 模式条件下，放大器连续监测微电极记录到的电压，而且可以注射连续电流。bridge 模式可保证由微电极产生的电流而引起的电压降（IRe) 被平衡或消零，这样就保证了细胞膜电位记录不失真。零点时，微电极 J?E 值能通过放大器控制面板直接读出。

桥式模式记录膜电位的优势在于电流注射和电压记录之间的切换过程不会出现电路噪声，dSECC 模式下也是这样。然而，电极电阻私常随时间和通过的电流而变化。因此，i?E 应该常被检测和平衡。许多研究人员常通过注射恒定值的小负相直流电流（持续 50?100ms, 间隔时间固定）来达到这样的目的（例如，在每次记录前给予这样的电流)。

（1）.微电极置于细胞外液时，对于所施加的电流，其反应应该接近于一方波（波的初始期和结束期呈快速瞬变变化)。通过提高电容补偿来最小化快速瞬变电流，并通过一个分压计以产生最快的衰减而避免产生超射或振荡等。

（2）.在找细胞和穿刺细胞时，应不断地调节电极电容。购买的放大器中常备有使用手册，内含有桥式平衡和电容的详细操作说明。

（3）.当有效地穿刺神经细胞并且在桥式记录的平衡以前，方波带来的电压变化 A_E 等于 iRE+Ji?N。在电容瞬变中，AE 达到一个峰值并以快相和慢相进行衰减。这与电极玻璃和细胞膜的时间常数有关。快相衰减成分可通过桥式平衡来消除，仅留下了一个慢相衰减电流成分（跨膜电流 IKn)。所施加的检测方波电流是恒定的，而且是已知的，则神经细胞的输入电阻能通过测量慢相电压成分来计算得出。

（4）.在胞内记录时，电极尖端的液界接触电位有时也会形成，这会导致错误地估计细胞的膜电位。微电极从细胞内退出时，仍然可记录到明显的负电位就是液界接触电位引起的。因此，真实的膜电位，是细胞内的测量值减去电极退出后所记录到值（逆向测量方法)。

2.非连续性单电极电流钳记录模式

在非连续的单个电极电流钳（dSECC) 记录中，放大器电路、采集电极、钳制电路和转换电路可以使微电极以高频率（kHz) 在通导电流和读取膜电压之间进行循环。假定 i?E 不是太大，此种特点，可以保证记录细胞的膜电位不受 IRe 的干扰. 切换频率必须足够高，通常十倍于膜的时间常数（J?mxCm), 这样就可保证膜电容（Cm) 能消除膜电压对于电流注射的反应。dSECC 的优势在于，在测量 i?N 时，_RE 小的变化将不会影响电极电压的测量。然而，由于来回切换，此种记录方法的噪声大于桥式记录模式。

此种记录的操作方法与 bridge 记录模式是一样的。

3.非连续性单电极电压钳模式

约 20 多年前，Dean 等（1976) 以非连续性单电极电压钳模式（dSEVC) 记录了活体脊髓运动神经元的膜电流。最近，这种方法也被用于活体记录其他神经细胞，包括某些呼吸神经细胞（Richteretal.1996)。dSEVC 模式记录神经细胞的理论已有详细描述，在此将做一’简介。描述电压谢的方法也可见参阅 Pellmar(1996) 和 HaIlimar 等 (1994) 〇

dSEVC 在测量电压和时间依赖性电流方面非常有效，而且时间分辨率也相当高。

主要错误在于细胞大小、形态和电极电学特性方面的限制。此外，此模式在测量膜电流时，由于不恰当的调节以及操作的复杂性易得到错误的结果。

dSEVC 系统包括一个命令电压源、缓冲器和反馈放大器、采集和钳制电路、切换电路，能够高速切换进行电流注射和电压记录。在事先设定的钳制膜电位下，记录在这种钳制电位下的膜电流。反馈电路把 IRe 已经衰减到零时记录到的膜电压（Vm) 和钳制电压（Vh) 进行比较。1 和 Vh 之间的任何差异（自发性突触电位 PSPs 或注射的方波电压梯度或斜波电流导致的）均被注射的电流补偿。注射的电流可被测量和记录，其值等于相应的跨膜电压（Vm) 下的跨膜电流（U, 但方向相反。

4.记录方法

I.dSEVC 记录的第一步，就是确保微电极本身正常工作。微电极本身不可以有稍许的整流作用，如通导正电流和负电流的能力一样，在注入电流后，Ve 必须迅速回复到基线水平。灌注后在显微镜下轻微撞击微电极尖端排除气泡，将提高电极的电流通导能力。微电极的快速恢复是记录高频的细胞膜电位 Vm 变化所必需的，Ve 则不需要。尽可能降低电极的电容可使电极恢复时间最短。降低电极电容方法有以下几种：拉制大锥度尖端的微电极（尽管当记录深层细胞时将导致较大的组织位移和损伤)，减少微电极的电极内液，记录神经组织表面上的细胞，电极尖端表面涂上降低电容的材料，在组织表面涂上矿物油（这些矿物油可以在电极尖端形成薄膜)，使微电极与前置放大器之间的电缆连线尽量短等。此外，用金属层屏蔽微电极，并把此金属层和单倍放大的前置放大器的外壳连接。不过，此方齢增加高频噪声。

最近，多种放大器已经商品化如 NPIElectronicGMBH 公司生产的放大器，它降低电极的恢复时间，提高记录 Vm 反应的能力（通过对高电阻的电极进行超级充电方法来实现)_玻璃微电极的超充电方法可用在 dSECC 和 dSEVC 两种模式上，可使尖电极 (40~80Mn) 的恢复时间降低到 2~3ms。再使用 25% 的限定时间（注入电流模式下所需要的时间）作为周期，可在注入电流-记录膜电位之间进行 30?40kHz 的切换频率。

2.在穿刺神经细胞前，微电极的特性应在 ECF 中进行测试，进行电压补偿以调零。在桥式记录模式下，监测注入电流带来的电压变化。桥式记录模式的平衡可消除微电极导致的快速电压瞬变。然后，将放大器转换成 dSECC 模式，调整电容补偿，降低在桥式记录模式下记录到的电压波形的变形，注入电流就应该记录到完全正常的电压波形。而且，微电极应该同样地通导极化和超极化电流。此时，规定的切换周期值被选定。短的切换周期值使电极更能完全复原。但是，就需要更大电流的注入，大电流就可能超出了微电极的电流通导能力。因此，25%?33% 的规定周期设置是比较合适的。

3.扎上细胞后，需要重新调整电桥平衡和电容补偿。在 dSECC 模式下，用示波器连续检测电极电压，确保电极能完全复原和合适的电容补偿。最佳的电容补偿设置是提供最大的切换频率，并且使注入电流能快速地衰减而不导致振荡。切换频率应保持足够高，以便能记录到快速变化的细胞膜电位，但又不能超过一定范围，否则，没有足够的时间让 IRe 衰减，导致转换的假象干扰记录。

4.然后，放大器被转换至 dSEVC 模式，并将膜电位钳制（Vh) 于预先设定的水平。直流电流源的开放式钳制放大倍率（nA/mV) 从零提高到恰当倍率。增益指的是 nA 的外向电流。该电流随着测试电压和膜电位之间的电压差（mV) 而改变。高增益能减少钳制误差（e, 膜电位与测试电位压之间的电压差)。高钳制误差 e 导致测量膜电流 Jm 的误差。如果增益设置太小，则电流测出来就小于真实值。另一方面，过高的增益也会导致^和 Vni 记录时，出现电流的饱和、接近饱和或振荡。因此，监控真实的细胞膜电位和测试电压同样重要。

四、存在问题

dSEVC 模式下，细胞几何形状和空间位置带来的问题。多数神经细胞在电流的分布上并不是紧凑的。远端树突产生的电流可能无法进行电压钳制，因为在胞体注入电流，传导到树突时有衰减。因此，通过胞体记录不能准确地反映远端树突产生的突触电流。此外，自发的动作电位也许不能很好地被钳制。反转电位可能被估高。

五、结果

利用 dSEVC 和超充电的方法，记录脑千组织深层的神经细胞实验结果

Richter 和同事，利用配置有超充电电路的放大器，记录了位于脑干髓质深层的呼吸神经细胞自发膜电流（Jm) 的波动情况。如图 5-12 所示，超充电电路的配置使没有涂层的尖电极（电极电阻 40~80Mn) 记录到了自发呼吸节律中膜电位（dSECC) 和膜电流（dSEVC) 的变化。同样，可很好地记录到高分辨率的快速自发突触后膜电流 (PSC)、突触后膜电压（PSPs)、刺激诱发的 PSCs 和 PSPs, 以及呼吸驱动的兴奋性和抑制性的慢电流和慢电压（快成分的 PSCs 和 PSPs 瞬时叠加产生的电流和电压)。

dSECC 和 dSEVC 模式下胞内微电泳

在细胞内记录中，可通过电极向细胞内注入可改变细胞内第二信使或膜离子通道的试剂。利用这种方法，Richter 及其同事分析了 cAMP 依赖的蛋白激酶 A、蛋白激酶 C 和 Ca2+电流对呼吸神经细胞活动模式的影响。带电的化学物质，借助电极的电流脉冲的驱动，可进入细胞内部。然后，研究了它们对呼吸节律性波动中 Jm、Vm 和 Jca 的影响。电流驱动的微电泳的好处是，从电极进入细胞内的物质的量与所施加的电流的电荷成比例。因此，可以据此计算剂量效应关系。并且，这些化学物质不会快速地渗入细胞内，保证了有足够的时间完成对照实验。当然，电压钳记录中的负电流钳制将不间断地驱使带负电荷的化学物质进入细胞。

胞内刺激

以下要讨论在 bridge 和 dSECC 模式下如何进行胞内刺激，以记录神经细胞的基本电生理特性。我们也简单地描述在 dSEVC 模式条件下电压脉冲施加的方法（用于鉴定不同类型的细胞膜电流)。

在 bridge 和 dSECC 模式下通过细胞内刺激方法研究神经细胞的功能特性。这两种模式下，细胞内刺激对于研究神经细胞基本特性非常有用，如细胞膜输入电阻、阈值、膜时间常数、电紧张长度、细胞总电容、动作电位的超极化后电位和发放特性等。

一细胞膜输入电阻（R): 通常注入超极化电流（波宽 50ms 或更大）后，测量相应的电压差

一阈值和细胞膜时间常数（r)

可得到动作电位发放阈值的几种方法：

电压钼中注入电流的操作程序

电压脉冲方法被用于分离和鉴别某种类型通道的全细胞电流，在不同膜电压范围内，全细胞电流能被激活或失活。下面只列出几个不同类型的细胞膜电流和脉冲刺激诱发方法。

1. 漏电流。要估计一特定类型膜电流的幅值，非特异性的漏电流必须去除。当去极化脉冲被用于激活和探测某电流时，可通过加超极化方波对漏电流进行补偿，并且从去极化脉冲减去这个补偿电流。在需要非常大的去极化脉冲时，较小超极化脉冲可通过计算机自动放大。

2. 钾电流。不同类型的钾电流，包括延迟整流钾电流（Kv)，快速失活 A 型钾通道电流（KA)，蕈毒碱受体激活电流（M)，内向整流钾电流（Kir), 钙依赖性电流 (Kca) 和钾敏感电流（JCAT)。A 型钾通道在静息膜电位时处于非活化状态。在一些神经细胞中通过钳制电位或先去极化到-60mV 再超极化，可使 A 型钾通道失活。然后，用持续的去极化脉冲可激活快速失活的 A 型电流。非活化的 M 型通道有一个去极化电压阈值（-60mV)，要激活 M 型通道（JJ, 需要把膜电位钳制到比较强的去极化如-30mV(T/h)，然后再给予持续的去极化方波（〇.5~ls) 到-60mV。其结果见图 5-13。M 型电流是慢的内向电流，缓慢地衰减。在活体猫的腰椎运动神经细胞电压钳实验中,Crill 等（1983) 在用 TTX 阻断钠通道后, 鉴定了快速和慢速类型的钾电流 Ikf 和 IKS。快速 Ik 与动作电位的快速复极化有关，而 Jks 似乎是钙依赖性的钾电流（图 5-14) 。
   

3. 钠电流。在哺乳类神经细胞上用电压钳方法已经鉴定出了快速、持续和再生的钠电流。通过应用钳制膜电位在负电位，然后施加不同的去极化方波，快速 rNa 已在猫腰椎运动神经细胞中用常规方法记录到。TEA 阻断 Jk 和钴阻断 Jca，将膜电位钳制于比静息膜电位正 20mV，使钠锋电流失活，然后给予一个 20mV 的去极化波，就能记录到与反复动作电位发放相关的持续钠电流。在长时间地去极化到膜电位+3 〇 mV，导致 1 他最大失活，然后给予一复极化电压（-60~-2 〇 mV)，可记录到对 TTX 敏感的「再生」钠电流。「再生」钠电流可能与小脑浦肯野神经细胞复杂的动作电位发放有关。