材料与仪器
步骤
一、材料
一麻醉剂：氨基甲酸乙酯、a-氯醛缩葡萄糖、戊巴比妥一手术器械：牙科钻、高频止血刀、镊子、剪刀、解剖刀、止血钳、骨钳、骨蜡、凝胶等
一加热毯和红外灯
—监控（肛）体温的无线温度计
—血压监测仪
—氧耗监测仪（吸入 O2, 呼出 CQ2)
—机械人工呼吸机
—手术显微镜
—防震台
一立体定位仪（头部固定仪和脊髓固定仪）
一用于微电极和刺激电极的微操作器
一电压/恒流刺激器和刺激隔离器
一可编程控制温度和拉力的玻璃微电极水平拉制器（细胞内记录）或垂直拉制器 (细胞外记录）
一电动微推进器（商品化的微操作器和微推进器已经结合在一起）—配置有带通和 50 Hz 或 60 Hz 滤波器的髙增益交流前置放大器（细胞外记录）一胞内记录用的直流放大器（如 Axoclamp2B) 一直流电压调零（用于录音机和示波器等记录）
注意：电压调零用来确保输入到磁带记录仪和示波器的信号不超过记录范围并且尽量减少驱动放大器的偏流直流不干扰信号分析。
—多通道示波器
一具有 IOkHz 频率响应的多通道示波器纸带记录仪
—音频放大器
注意：音频放大器对于检测动作电位非常有用。通常，先听到细胞的动作电位发出后，再在示波器或记录仪上看到。此外，也能听到胞内记录时的突触噪 声。许多有用的信息可以通过阈下突触后膜电位的声音获取，如这些声音和其他被检活动发生的时间顺序, 微电极插入细胞后的细胞状态等。
一神经元放电的幅度或波形甄别器和记录发放频率的部件（通常由软件或硬件来实现，这里指的是硬件）
—数字化磁带记录仪
—法拉第屏蔽罩
注意：在记录微弱的生物电信号时（例如，胞外记录的电位在微伏到毫伏之间）需要高倍放大，因此，法拉第屏蔽罩通常排除外源电信号的干扰，如它在实 验室灯光和电源的干扰中是必需的。但是，如果将动物和仪器设备等仔细地接地，没有法拉第屏蔽罩也能将干扰降低到可接受的水平。有效的接地方法是，将所有电 生理设备连接到一个共地点上（共地接线柱)，这个共地点再与直流或交流前置放大器的接地端相连。另一个降低噪声的方法是，将放大器用铝箔包裹，然后用导线 将铝箔与共地接线柱连接起来。
一数据采集和分析的微处理器（如数模转换卡)、计算机以及软件注意：有各种商品化的微处理器、数模转换卡和软件，这些供货商有 Axon 公司、英国剑桥电器设备公司等。这些系统不仅在分析已储存的数据时非常有用，而且也能实时显示和分析，因此不需要示波器和纸带记录仪持续的记录和打印。
—数据备份设备
二、实验准备程序
这里我们描述了活体动物中记录神经信号的普通操作程序。记录生物电位的特殊性方面将在第 2-4 部分讨论。图 5-2A 主要阐述手术后和记录电极埋置后的操作程序。图 5-2B 总结了不同的电极以及它们检测不同生物电位的用途。
1.可选择的准备：麻醉或去大脑皮层
是否使用麻醉或去大脑皮层动物，是由实验的目的和麻醉对神经元的影响决定的。
大多数全麻药物具有抑制运动和稳定神经元自发放电模式的优点，从而增强了记录的稳定性。然而，由于它们对兴奋性突触的抑制和对抑制性突触的影响限制了麻醉剂的应用，例如，泌尿膀胱反射会被麻醉剂量的巴比妥酸盐显著抑制，决定了该实验只能应用非麻醉的去大脑皮层动物或使用 a-氯醛糖。把脑干的中丘脑以上的大脑皮层切除进行实验，可以避免麻醉带来的问题。但是，这样的实验准备需要更长的时间，困难也更大。
2.手术前药物处理
手术前应该注射阿托品以阻止动物的唾液分泌从而抑制呼吸。根据动物品种和给药途径的不同，有效的剂量范围为 0.1~0.3 mg/kg。最好注射溴代甲烷阿托品，因为它不像硫酸阿托品，后者能够穿透血脑屏障。手术前使用 0.3 mg/kg 的地塞米松可以有效地把开颅术或椎板切除术引起的中枢神经组织水肿减至最轻。当手术过程很长时，最好在记录期间缓慢静脉注射乳酸林格液（lactatedringersolution) 或者葡萄糖-林格液 (glucose-ringersolution) 。
3.手术方法
开颅术、椎板切除术和打开硬脑膜不仅是为了让中枢神经组织暴露以便看清脑表面、准确地插入微电极，而且可以使脑脊液引流，保证了记录的稳定性_高质量的记录应该尽量做到这一点，并且使神经组织的损伤最小，形成的疝也最小。通常，两侧胸廓切开术可以最大限度降低自发呼吸带来的脑和脊柱组织的移动，从而进一步使记录稳定。胸廓术一般用加拉碘铵（起始 4~10 mg/kg, 然后 4~10 mg/h) 或者泮库溴铵（起始 0.1~0.211^/1^，然后 0,07~0.111^/11) 静脉注射麻醉和用人工呼吸机维持呼吸。为了避免胸廓术导致的肺脏萎陷（气胸)，需要通一根与人工呼吸机输出端相连接的导管，施加压强 133~266Pa。
其他操作有助于记录的稳定性，包括：把切开的硬脑膜边缘利用细结扎线或氰基丙烯酸盐黏合剂固定到周围的骨或肌肉、在骨与组织之间加入含 3% 琼脂的林格液作为渗透隔离、切除所有暴露组织的蛛网膜及在微电极插入的位置上放置一个压力座。同时，必须清除记录点周围的软组织膜，以避免这些组织阻碍电极的插入或损坏微电极尖端。
手术后，所有暴露的组织表面应该用琼脂液、石蜡油、凡士林石蜡油的混合物或潮湿纱布覆盖。这样可以避免组织干燥，因为组织干燥会导致肌肉收缩和组织的快速衰竭 O
4.微电极插入和记录中神经组织的准备
无论用什么类型的电极，也不管是细胞内还是细胞外记录，重要的是要使神经组织适合微电极的插入。和以前提到的一样，必须去除硬脑膜。如果用的是玻璃微电极或者金属微电极，为了避免它们的精细脆弱的尖端受损，蛛网膜也需要去除。另外，如果是细胞内记录，就必须去除覆盖在记录点上的软脑膜碎片。在微电极推进时，由于组织的收缩最后反弹，会导致神经组织表面的损伤和插入电极的轨迹途中的神经元损伤，并且不能精确计算插入电极的深度。在去除膜组织时，要注意尽量避免组织表面出血，因为这样会导致插入电极困难和损伤微电极尖端。
同样重要的是，要尽量避免组织表面聚集太多的脑脊液。表面脑脊液会增大电容，降低微电极的反应时间（导致高频信号失真)。通常，脑脊液聚集是由于没有做到足够好的人工呼吸供氧，导致血浆和组织中的二氧化碳分压太高。这种情况可以通过提髙人工呼吸供氧效率来得到改善。同时，在手术区域的边缘放置脱脂棉也可以非常有效地吸收过多的脑脊液。
5.实验前的接地
在活体动物实验中，用银丝或铂金丝（交流信号记录)、氯化银丝（直流信号记录）将潮湿的非神经组织接地。现在，连有导线的氯化银圆盘可以直接买到，是最理想的接地材料。银、氯化银、铂金丝用林格液浸湿的脱脂棉包裹后，放入组织中和肌肉紧贴，也可以放入动物嘴中。非常重要的是要保持脱脂棉始终饱和地浸润着电解液。
三、寻找细胞
在这部分，我们讲述在脑或脊髓组织中寻找细胞，进而胞内或胞外记录细胞活动的一般程序，
1.放大器增益和滤波
在寻找细胞进行胞内记录时，一般用 1 〇倍的放大倍率。对于胞外记录，交流放大器的放大倍率一般采用 1000~5000 倍来探测单位放电和诱发场电位。胞外记录的滤波带宽一般为 100~3000 Hz。
2.微电极推进操作器
目前，有各种各样的高精度微电极推进器可供选择使用。在活体实验中，比较方便的是配置一? 个 X-Y-Z 三维电动或者液压驱动的微操作器，或者机械微操作器，如 NarishigeCanberra 型微操作器。这些设备极大地方便了把驱动装置和微电极放置在将要插入组织的上方。然后，微电极在微操驱动下进入组织。对于细胞外记录』油压驱动的微操作器可以达到满意的程度。但是，这种油压微操在进行胞内记录时有些困难，因为它不能高速度步进驱动微电极穿入神经元。另外，由于驱动系统中与油的温度相关的收缩和膨胀，使得这种微操的稳定性降低^因此，配置电动或压电驱动的微操是最理想的，这些设备可从许多仪器设备公司直接购买到。这些商品化的设备可以通过遥控，使微电极以不同的速度和加速度进行小步进或大步进或连续推进，引起的电极反弹或电极偏离非常小。小步进和高速推进电极，使得穿入细胞变得非常容易，对细胞的损伤也最小。某些品种的电动驱动微操有一个缺点，那就是带来高频噪声，这种高频噪声对诸如听觉神经生理实验带来麻烦。
3.电极清理以便探测和穿入神经细胞
聚集在电极尖端和中部的组织会增大电阻并导致噪声増大，使得探测到细胞活动更加困难，并且也将导致在电极穿入神经元时损伤细胞膜。为了保持微电极尖端的干净，可以在每进几步（每步几个微米）后, 通过开关或触发电路给微电极一个波宽为 13 的正向电流（lOOnA)。正向电流也能帮助微电极穿过细胞膜。现在，许多新型的胞内记录放大器都配置有电流清理功能的部件。另外，也可以通过手动或电动开关控制刺激器，输出一个类似的正向电流到微电极。
4.利用场电位定位记录细胞
神经元是成簇分布的，通常很容易通过电刺激诱发逆行或少突触传递产生的场电位来定位。电刺激诱发的场电位的波形和波幅通常可以用来指导微电极的推进，最终到达目的神经元。例如，在骶骨位置的脊髓，刺激腹根神经，在骶骨副交感神经节前神经元产生一个表面正向的场电位，当微电极靠近时，记录到的场电位的波幅会增大；当微电极穿入到节前神经元簇内部时，这个场电位就变成负向，也就表明了微电极到达了目的神经元区。某个区域中的神经元，可以通过逐渐降低刺激强度，直到检测到某个单位放电随着刺激强度的降低而消失，并且随着刺激强度的增加又恢复。其他例子，如刺激迷走神经诱发的场电位也可用来定位迷走神经节前神经元和延髓质中呼吸 R13 神经元。
5.胞外记录的单位放电的波幅和波形
自发或诱发的胞夕卜记录单位放电一般波幅都小于 1 毫伏，并且为负向，当微电极离细胞相对较远时出现三相（负-正-负)。在单位放电的上升相中，常常出现一个小的反相波，这是轴突单位放电带来的。通常，电极尖端和轴突接触时就会产生这种小波。如图 5-3 中描述的一样，当电极非常靠近细胞时，胞外记录的电位呈负-正相，幅度超过 5 毫伏。这种记录方法将在下面的实验方案 2、3 两部分进行阐述。
来源：丁香实验
