比较分子生理基因组学 —cDNA阵列的异种杂交实验

最新修订时间：2024-05-13

材料与仪器

步骤

一、材料

这里用到的所有化学试剂都为分子生物学等级，或者用它们最高纯度的等效物。所有的塑料和玻璃制品，包括瓶子和移液器吸头都要高压灭菌，在核酸实验操作过程中必须始终戴手套。 cDNA A T L A S阵列从Clontech购得。人 19K cDNA 阵列从Ontario 癌症研究所购得。

1 总 RNA 的提取

（1）焦碳酸二乙酯（DEPC) (Sigma-Aldrich， St. Louis, MO) 加人水中，终浓度为0 . 1 % 搅拌过夜（> 1 2 h)，高压灭菌。吸头、管子和其他塑料或玻璃
制品可以购买无 RNase 的或者在 DEPC 水中搅拌过夜，去除 RNase。这部分实验所有的溶液制备和 RNA 样本溶解都需要使用 DEPC 水和无 RNase 的塑料或玻璃制品。

（2）TRIzol 溶液（Invitrogen， Carlsbad， CA)。

（3）氯仿（Fisher Scientific, Fairlawn， NJ)。

（4）异丙醇（Fisher Scientific)。

（5）7 0 % 乙醇。于 70 mL 无水乙醇（Pharmco， Brookfield, CT) 中加人 30 mLDEPC 水。

2 RNA 变性凝胶电泳

$1 . 1 0 父 1 \ / 〇 ? 3 缓冲储液： 2 0 〇 1 1 1 1 1 1 〇 1 / 1 ^ ] \ / [ 〇 ? 3 [ 3 - ( ] ^ 1 1 1 〇印 1 1 〇 1 ^ 1 〇 ) ? 1 ：〇卩&1165111{〇 11记 acid], 50 mmol/L 乙酸钠， 10 mmol/L EDTA， pH 7。 2. 1 % (WVV) 琼脂糖甲醛变性胶：在一装有217 m L双蒸水的无菌烧瓶中溶解3g 琼脂糖，加入溴化乙锭（ EB， lfxg/mL)。将溶液置于55°C 的恒温箱中。在另外一个无菌烧瓶中加入30 mL MOPS 10 X 缓冲液和 53 mL 3 7 % 甲醛溶液（ V./VO 后，置于 55°C 。当两种溶液都稳定在55°C后，在通风柜中混合并轻微摇晃，不要产生气泡。倒入大的制胶板中至所需厚度。 3. RN A样品缓冲液： IXM OPS缓冲液， 2 . 2 mol/L 甲醛， 5 0 % ( V/V) 甲酰胺。 4. R N A 上样缓冲液6X 储液： IXM OPS缓冲液， 5 0 % (W ) 甲酰胺， 4 0 % (V/ V O 甘油。加人少许溴酸蓝和二甲苯青作为指示剂。$

3 mRNA 提取

（1）Oligotexpoly (A )+ mRNA 提取试剂盒（Qiagen)。注意：下面列出的 3 种缓冲液是试剂盒配套试剂。 ,

（2）Oligotex 结合缓冲液（OBB): 20 mmol/L Tris-HCl， pH 7.5， lm ol/L NaCl,2 mmol/L E D T A , 0 . 2 % (W V ) 十二烷基磺酸钠（SDS; Sigma-Aldrich)。

（3）Oligotex 清洗缓冲液（OWB): 10 mmol,/L Tris-HCl, pH 7. 5， 150 mmol/LNaCl， I mmol/L EDTA。

（4）Oligotex 洗脱缓冲液（ OEB) : 5 mmol/L Tris-HCl， pH 7. 5。

4 cDNA 探针合成

（1）1μg mRNA 样本。

（2）聚合酶链反应（ PCR) 仪 [ 例如 Bio——Rad iCycler (Bio-Rad)， PTC-100 (MJ Research)]

5 DNA 阵列杂交和清洗

（1）Church 缓冲液： 0.25 mol/L Na₂ HPO₄, 0.25 mol/L NaH₂PO₄, pH 7. 5 ， 7 %SDS (W/V)

（2）20XSSC: 3. 0 mol/L NaCl， 0•3 mol/L 梓釋酸钠（Sigma-Aldrich)。

（3）2 0 % SDS (W / V )

（4）酵母 tRNA (10 mg/mL) (Invitrogen)。

（5）小牛胸腺 DNA (10 mg/mL) (Sigma)。

（6）DIG Easy Hybe 溶液（Roche)。

6 DNA 阵列分析

（1）X 光底片或磷屏成像系统（用于 ATLAS^TMcDNA 阵列）。

（2）微阵列分析仪（分析人的 19K cD N A 阵列）。有很多公司 ( AlphaInn 〇 tech、 Affymetrix、 VersArrayChipReader) 销售阵列分析仪，但有些公司或服务机构(还有很多研究所的设备中心）能够提供收费的阵列扫描和分析服务，这样比购买一台分析仪要经济得多。

3 . 可以下载的分析软件（例如 Scanalyze; http://rana.lbl.gov)。

7 结果验证：半定量反转录酶_聚合酶链反应（RT-PCR)

（1）DNAman 软件（Lynnon Biosoft)。

（2）引物设计软件（Scientific and Educational Software)。

（3）BicrRadiCycler (Bio^Rad) 或其他梯度 PCR 仪。

（4）50XTAE 缓冲液： 242 g Tris 碱， pH 8. 5, 57. Im L 冰乙酸， 37.2 gEDTA ， IL 双蒸水。

（5）1 % T A E 琼脂糖凝胶： I X T A E 缓冲液， 1 % 琼脂糖（ W/V） , 溴化乙锭（1 μg /mL) 加入到 100 mL 水中。

（6）DNA 上样染料： 0.25% (W/V）溴酚蓝， 0.25% (W/V ) 二甲苯青， 5 0%(W /V ) 甘油。

（7）DNA 分子质量标准（Invitrogen)。根据预期的 PCR 产物大小选择合适的分子质量标准（从 100 bp 到几 kb 不等)。

二、方法

在开始任何微阵列实验之前，必须要选定合适的对照和时间点，这样获得的数据才有生物学意义。关于如何选择合适的对照，参见注释 1 和 2。

1 总 R N A 的提取

1. Poly (A ) + mRNA提取试剂盒可用于冰冻组织样品中poly (A )+HiRNA的富集；但是经验告诉我们采用试剂盒进行一步法提取时得率一般较低。我们建议采用传统的总RNA提取方法，并对 RNA进行检测以保证较好的质量，然后进行 mRNA的提取和阵列的杂交。 2. 对照和实验样品在TRIzol中匀浆（每 100 m g冰冻组织加入I mL TRIzol)，迅速加入氯仿（每 I mL TRIzoI 中加入0. 2 mL)。反复快速颠倒混匀15 s 后于室温孵育5 min。 4°C下以最高速离心10 min。 3. 将上层液体转移到一个无菌的无RNase的 Eppendorf管中，加人等体积异丙醇沉淀 RNA。于室温孵育10 min。 4. 4°C下最高速离心10 min沉淀 RNA。将上清小心弃去，用 7 0 % 乙醇（250 pL) 清洗沉淀，最高速再次离心5 min。倒掉乙醇，让沉淀晾干。小心不要使沉淀过分干燥，这可能会给重溶带来一定的困难。以大约每10 jug沉淀加人10 fxL水的比例将 R N A 溶于 DEPC水，一20°C保存（如果可以于一周内使用）或 —80°C (长期保存）保存。 5•利用分光光度计通过测定260 nm和 280 nm的吸光值检测R N A的浓度和纯度。纯度较好的RNA A26。： A28。的值应介于1. 6 和 2. 0 之间。再进一步通过RNA 凝胶电泳检测R N A的质量。根据4 0 畔 RNA A26。为 1. 0 0 的标准，计算 10〜20 砘总 R N A的量。

2 R N A 变性凝胶电泳

（1）制备一块 1 % 的琼脂糖甲醛变性胶，浸没在 IXM OPS 缓冲液中，胶上的孔应被溶液完全没过。将胶预电泳 15 min (与此同时准备 RNA 样品）。

（2）取适当体积的总 RNA (含有 10〜2 0 μg RNA)，加人到置于冰上的标记管中，用 DEPC 水调整总体积到 15 μL。向每管中加入 15 μLRNA 样品缓冲液和 6 μL6X RNA 上样缓冲液。

（3）将样品于 55°C 孵育 10 min, 迅速置于冰上。向每管中加入适当体积的 R N A 上样缓冲液，使每个样品中的上样缓冲液达到 I X 的终浓度。

（4）将 RNA 样品轻轻混匀，短暂离心，将所有的样品都收于 Eppendorf 管的底部。

（5）将每个管中所有的样品都加到胶孔中，记录加样顺序。

（6）于 100 V 进行电泳，当指示染料的前端到达胶底部时结束电泳。胶置于塑料膜上，于紫外灯下观察电泳结果。 28S 和 18S 核糖体 RNA (rRNA) 条带作为RNA 质量的判断标准，两者比例应该约为 2 : 1 。这一步保证了 D N A 阵列杂交用 mRNA 提取之前的总 R N A 的质量。虽然总 R N A 也可用来进行探针合成，但是我们推荐使用 mRNA。当 28S rRNA 与 18S rRNA 条带的比例远不足 2 : 1或样品条带出现弥散时，可认为 R N A 的质量比较差（关于微阵列分析所用R N A 的最大量见注释 3)。