利用肽底物分析CaMKⅠ和Ⅱ

反应缓冲液
磷酸纤维素滤纸 离心管

1. 准备 P81 磷酸纤维素滤纸。

(1) P81 磷酸纤维素滤纸切成 2cmX2cm 的方块，折起一个角，用铅笔在这里做个记号。

(2) 将膜块放在一大张非吸收性材料上，如有机玻璃或者盖着铝箔的纤维板。

2. 设置和标记进行分析反应的离心管。

反应体积可以是 25~100 μl。对于 50 μl 反应，加入下列溶液：

10X 反应缓冲液 5 μl

10X 底物溶液 5 μl

水 0~34 μl

10X ATP 5 μl

激酶样品，如纯化的激酶或细胞裂解物 1~35 μl

3. 制备合成的肽底物（一般是 10 mmol/L 的 10X 肽底物溶液）。

(1) 用 Milli-Q 纯化的水溶解适量的肽，配成 10 mmol/L 的溶液。

(2) 肽溶液在保存或使用前将 pH 调至 pH 7.4。大多数肽保存于 -70℃ 很稳定。然而对于个别的肽底物必须检测在保存条件下的稳定性。

4. 将激酶样品除外的其他反应成分加入进行反应的离心管。

5X CaMK 分析缓冲液 10 μl

10 mmol/L CaMK 肽底物溶液 5 μl

[γ-³²P] ATP（终浓度 5 μCi/5 μmol/L ATP) 5 μl

100 μg/ml 钙调蛋白或水 5 μl

水（取决于下一步所加的激酶样品的量） 0~25 μl

5X CaMK 分析缓冲液：

100 mmol/L Tris-HCl (pH 7.5)

25 mmol/L MgCl₂

1 mmol/L CaCl₂

钙调蛋白储存液（Calbiochem)

1 mg/ml，溶于 Milli-Q 纯化的水

分成小份，-70℃ 保存

5. 盖上离心管，加入始发反应物前加热至 30℃，维持 5 分钟。

6. 每 30 秒依次往置于 30℃ 预热的反应管加入 1~25 μl 激酶样品启动反应。

7. —旦达到所需的实验时间，迅速从每管吸出 30 μl 反应产物到切成小方块的 P81 滤纸上。立即将 P81 滤纸放入装着 75 mmol/L 正磷酸的烧杯。

8. 5 分钟后，将磷酸倒入收集 ³²P 废液的容器。再加入 75 mmol/L 正磷酸，搅拌 5 分钟以上。如此冲洗 P81 滤纸 5 次。

9. 加入丙酮，清洗 5 分钟。倒去丙酮，让膜自然晾干。

10. 将每张 P81 滤纸放入一个 20 ml 的液闪计数管，用液闪计数器测定放射性。