原理
在合成过程中，低浓度的放射性标记的 dNTP 使探针的长度限制为 200~300 个核苷酸。但是新合成的 DNA 可通过改变投入的模板量和 dNTP 的浓度使其长度为 100~1000 个核苷酸，如此长度范围内的探针适用于大多数杂交实验。
材料与仪器
大肠杆菌 DNA 聚合酶 I Klenow 片段 寡核苷酸引物 模板 DNA
洗脱缓冲液 甲酰胺染色缓冲液 NaOH 探针合成缓冲液
聚丙烯酰胺凝胶 空气孵箱或水浴摇床 沸水浴 一次性接种棒 加热板 塑料 snap-cap 管
洗脱缓冲液 甲酰胺染色缓冲液 NaOH 探针合成缓冲液
聚丙烯酰胺凝胶 空气孵箱或水浴摇床 沸水浴 一次性接种棒 加热板 塑料 snap-cap 管
步骤
一、材料
1. 缓冲液和溶液
洗脱缓冲液（1X SSPE 含 0.5% SDS）
甲酰胺染色缓冲液
MgCl2 ( 1 mol/L)
NaOH (10 mol/L)
3X 探针合成缓冲液（dATP、dTTP 和 dGTP ( 各 62 pmol/L），0.5 mg/ml 牛血清白蛋白（组分V，Sigma 公司），625 μmol/L DTT，32 mmol/L Tris-Cl (pH 7.5)，6.5 mmol/L MgSO4）
2. 酶和缓冲液
大肠杆菌 DNA 聚合酶 I Klenow 片段
3. 凝胶
含 7 mol/L 尿素的聚丙烯酰胺凝胶（5 %)
4. 核酸与寡核苷酸
寡核苷酸引物（M13 噬菌体通用引物或定制的寡核苷酸）
模板 DNA
5. 放射性复合物
[α-32P] dCTP ( 10 mCi/ml，800~3000 Ci/mmol)
6. 专用设备
预热至 50℃ 的空气孵箱或水浴摇床
沸水浴
一次性接种棒
多孔（fritted) 柱（Quik-sep 柱，Isolab 公司）
预热至 57℃ 的加热板
塑料 snap-cap 管（12 X 17 mm)
二、方法
1. 在 0.5 ml 微量离心管中混合：
单链模板（M13 噬菌体或噬粒 DNA)
( ~0.15 pmol，~0.1 μg/μl） 0.3 μg
寡核苷酸引物 1 μl
25 mmol/L MgCl 1 μl
如可能，可在每次实验中设阳性对照反应，其中含有对照 DNA 模板或经实验证实反应良好的寡核苷酸。
2. 盖紧管盖，在 57℃ 加热板上温育反应物 5~10 min。
3. 将微量管从加热板移至冰上，再加入如下混合物：
3X 探针合成缓冲液 4 μl
10 mCi/ml [α-32P] dCTP
( 比活性 3000 Ci/mmol） 3 μl
Klenow 片段（约 2.5 单位） 0.5 μl
轻敲管壁以混合各组分，以最大速度离心 1~2s 使所有液体沉降到管底，37℃ 温育反应物 40 min。
4. 在进行引物反应的同时，可灌制含 7 mol/L 尿素的 5% 聚丙烯酰胺凝胶（用 1X TBE 缓冲液配制）。凝胶的厚度为 1.5 mm，长度至少为 15 cm，加样孔宽度为 2.5 cm。20~25 V/cm 电泳 15 min，以除去加样孔中的过硫酸胺。
5. 加入 25 μl 的甲酰胺染料缓冲液，在沸水浴中加热反应物 3~5 min，以终止引物延伸反应。将微量管移至冰上，加入 1 μl 1 mol/L NaOH。
6. 用注射器吸取 1X TBE 缓冲液，冲掉加样孔中的尿素和松散的聚丙烯酰胺凝胶碎片后，立即将 DNA 样品加至加样孔中。电泳 30 min，电压为 20~25 V/cm，使模板 DNA 与放射性标记探针分离。
7. 电泳 30 min 后，分离取下凝胶，将凝胶包在 Saran Wrap 包装膜中，通过放射性自显影定位放射性标记的 DNA。将凝胶在 X 线片上曝光 1 min。
8. 用清洁的剃须刀片从凝胶中切下有放射活性的区带，放入12 X 17 mm 的带弹性盖 (snap-cap) 的塑料管底部，用一次性接种棒捣碎后，加入 1~2 ml 洗脱缓冲液，50℃ 下振荡 >3 h。
9. 将洗脱液吸入多孔（fritted) 柱，将柱置于塑料 snap-cap 管，用台式离心机离心 1~2 min。用液体闪烁计数仪检测 1 μl 放射性探针的放射活性。
1. 缓冲液和溶液
洗脱缓冲液（1X SSPE 含 0.5% SDS）
甲酰胺染色缓冲液
MgCl2 ( 1 mol/L)
NaOH (10 mol/L)
3X 探针合成缓冲液（dATP、dTTP 和 dGTP ( 各 62 pmol/L），0.5 mg/ml 牛血清白蛋白（组分V，Sigma 公司），625 μmol/L DTT，32 mmol/L Tris-Cl (pH 7.5)，6.5 mmol/L MgSO4）
2. 酶和缓冲液
大肠杆菌 DNA 聚合酶 I Klenow 片段
3. 凝胶
含 7 mol/L 尿素的聚丙烯酰胺凝胶（5 %)
4. 核酸与寡核苷酸
寡核苷酸引物（M13 噬菌体通用引物或定制的寡核苷酸）
模板 DNA
5. 放射性复合物
[α-32P] dCTP ( 10 mCi/ml，800~3000 Ci/mmol)
6. 专用设备
预热至 50℃ 的空气孵箱或水浴摇床
沸水浴
一次性接种棒
多孔（fritted) 柱（Quik-sep 柱，Isolab 公司）
预热至 57℃ 的加热板
塑料 snap-cap 管（12 X 17 mm)
二、方法
1. 在 0.5 ml 微量离心管中混合：
单链模板（M13 噬菌体或噬粒 DNA)
( ~0.15 pmol，~0.1 μg/μl） 0.3 μg
寡核苷酸引物 1 μl
25 mmol/L MgCl 1 μl
如可能，可在每次实验中设阳性对照反应，其中含有对照 DNA 模板或经实验证实反应良好的寡核苷酸。
2. 盖紧管盖，在 57℃ 加热板上温育反应物 5~10 min。
3. 将微量管从加热板移至冰上，再加入如下混合物：
3X 探针合成缓冲液 4 μl
10 mCi/ml [α-32P] dCTP
( 比活性 3000 Ci/mmol） 3 μl
Klenow 片段（约 2.5 单位） 0.5 μl
轻敲管壁以混合各组分，以最大速度离心 1~2s 使所有液体沉降到管底，37℃ 温育反应物 40 min。
4. 在进行引物反应的同时，可灌制含 7 mol/L 尿素的 5% 聚丙烯酰胺凝胶（用 1X TBE 缓冲液配制）。凝胶的厚度为 1.5 mm，长度至少为 15 cm，加样孔宽度为 2.5 cm。20~25 V/cm 电泳 15 min，以除去加样孔中的过硫酸胺。
5. 加入 25 μl 的甲酰胺染料缓冲液，在沸水浴中加热反应物 3~5 min，以终止引物延伸反应。将微量管移至冰上，加入 1 μl 1 mol/L NaOH。
6. 用注射器吸取 1X TBE 缓冲液，冲掉加样孔中的尿素和松散的聚丙烯酰胺凝胶碎片后，立即将 DNA 样品加至加样孔中。电泳 30 min，电压为 20~25 V/cm，使模板 DNA 与放射性标记探针分离。
7. 电泳 30 min 后，分离取下凝胶，将凝胶包在 Saran Wrap 包装膜中，通过放射性自显影定位放射性标记的 DNA。将凝胶在 X 线片上曝光 1 min。
8. 用清洁的剃须刀片从凝胶中切下有放射活性的区带，放入12 X 17 mm 的带弹性盖 (snap-cap) 的塑料管底部，用一次性接种棒捣碎后，加入 1~2 ml 洗脱缓冲液，50℃ 下振荡 >3 h。
9. 将洗脱液吸入多孔（fritted) 柱，将柱置于塑料 snap-cap 管，用台式离心机离心 1~2 min。用液体闪烁计数仪检测 1 μl 放射性探针的放射活性。
来源：丁香实验
