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Southern印迹(DNA从一块琼脂糖凝胶上同时向两张膜转移)

相关实验:Southern印迹(DNA从一块琼脂糖凝胶上同时向两张膜转移)

最新修订时间:

原理

DNA 可以同时从琼脂糖两面向两张膜上转移。当需要用两种不同的探针分析相同的限制性内切核酸酶酶切片段时,这种方法是很有用的。DNA 片段转移速率较快,但是由于凝胶中的液体从两侧同时流出导致脱水速率太快,所以转移效率较低。当靶序列的浓度较高时这种方法效率最高,例如分析克隆的 DNA 时(质粒、噬菌体、黏粒、PAC 或 BAC ) 或者不太复杂的基因组时。用这种方法转移的哺乳动物的基因组 DNA 太少以至不能重复或及时地检测到单拷贝序列杂交信号。

材料与仪器

限制性内切核酸酶 DNA 分子标记物 靶 DNA
变性溶液 HCl 中和缓冲液 中性转移缓冲液 SSC 蔗糖凝胶上样缓冲液 SYBR Gold 或溴化乙锭
无溴化乙锭的琼脂糖凝胶 交联设备 玻璃烤盘 尼龙或硝酸纤维素膜 旋转振荡平台 厚的吸水纸 荧光标记的透明尺

步骤

一、材料

1. 缓冲液及溶液

变性溶液(1.5 mol/L NaCl,0.5 mol/L NaOH)

HCl ( 0.2 mol/L) 应用于 DNA 脱嘌呤

中和缓冲液(1 mol/L Tris ( pH 7.4),1.5 mol/L NaCl)

中性转移缓冲液(10X SSC)

6X SSC

6X 蔗糖凝胶上样缓冲液

SYBR Gold 或溴化乙锭

2. 酶及缓冲液

适当的限制性内切核酸酶

3. 凝胶

用无溴化乙锭的 0.5X TBE 或 1X TAE 配制的 0.7% 的琼脂糖凝胶

4. 核酸及寡聚核苷酸

DNA 分子标记物

靶 DNA

5. 专用设备

交联设备(例如 Stratalinker, Stratagene; GS Gene Linker, Bio-Rad), 或者微波炉,或真空炉

玻璃烤盘

玻璃板

尼龙或硝酸纤维素膜

旋转振荡平台

厚的吸水纸(例如,Whatman 3 MM, Schleicher&Schuell GB004, 或 Sigma QuickDraw)

荧光标记的透明尺

重物(400 g )

二、方法

1. 消化 DNA 并根据方案“Southern印迹(毛细管法将 DNA 转移到膜上)”步骤 1~3 所述凝胶电泳分离 DNA 片段。

2. 凝胶电泳分离 DNA 以后,用溴化乙锭或 SYBR Gold 染色并照相。将一透明荧光尺放在凝胶边缘以便从照片上根据迁移距离直接读出 DNA 条带的大小。在中性条件下准备转移用的凝胶。

3. 用干净的解剖刀或切纸机切下两张每边都比凝胶大 1~2 mm 的尼龙或硝酸纤维素膜。切下膜的一角,使之与凝胶的切角对应。切 4 张与膜同样大小的厚吸水纸。

4. 将膜漂浮于盛有去离子水的皿中直到膜从下往上完全浸湿,然后将膜浸入 10 X SSC 中至少 5 min。

5. 每层都用吸管赶走气泡,尤其是膜与凝胶之间。将一张膜放在两张潮湿的吸水纸上。将凝胶放在膜上,二者切去的一角对齐。立即将另一张膜放在胶的另一面,然后是两张潮湿的吸水纸。

6. 将夹在一起的吸水纸、膜以及凝胶放到 5~10 cm 高的一叠纸巾上。上面再放置一叠纸巾。将一块玻璃板放在纸巾上并用 400 g 重物压实。

7. 2~4 h 之后,移去吸水纸及纸巾。将凝胶和膜转移到干燥的吸水纸上,用一支极软铅笔或圆珠笔标记凝胶加样孔的近似位置。

8. 将 DNA 固定于膜上。

9. 直接用探针与固定的 DNA 杂交。

任何不立即用于杂交的膜都应当充分干燥,松弛地包于铝箔纸或吸水纸中,室温下最好保存在真空条件。

来源:丁香实验

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