原理
本方案由 Ramirez-solis 等的方法 1992，1993 改进而成，是一种从微培养板的每个孔生长的真核细胞抽提基因组 DNA 的简便有效的方法。每个孔产生的基因组 DNA 足以做数次聚合酶链反应（PCR) 或者一次 Southern 杂交。对于制备用于 PCR 反应的基因组 DNA 的最佳方法。
材料与仪器
限制性内切核酸酶 无 DNase 的 RNase 细胞
细胞裂解缓冲液 乙醇 NaCl 乙醇溶液 磷酸盐缓冲液 蔗糖凝胶上样缓冲液 TE
抽气设备 多通道移液器 温箱 振摇平台 Tupperware 容器
细胞裂解缓冲液 乙醇 NaCl 乙醇溶液 磷酸盐缓冲液 蔗糖凝胶上样缓冲液 TE
抽气设备 多通道移液器 温箱 振摇平台 Tupperware 容器
步骤
一、材料
1. 缓冲液和溶液
细胞裂解缓冲液（10 mmol/L Tris-Cl (pH 7.5)，10 mmol/L NaCl，0.5% (m/V) Sarkosyl）
乙醇
NaCl/乙醇溶液
磷酸盐缓冲液（PBS )
蔗糖凝胶上样缓冲液
TE (pH 8.0)
2. 酶和缓冲液
限制性内切核酸酶
无 DNase 的 RNase
3. 专用设备
与带阀门的真空管相连的抽气设备
多通道移液器，8 或 12 道
温箱，预设至 60℃。
振摇平台
Tupperware 容器
4. 细胞和组织
在 96 孔微培养板上生长的细胞
二、方法
1. 用蓝色尖头或者巴斯德移液管吸去 96 孔培养板每个培养孔中的培养液。
只要小心不接触细胞层，通常不用毎个培养孔换新的尖头。
2. 每个培养孔中的细胞用 100 μl 磷酸盐缓冲液冲洗 2 次。
3. 用多通道移液器在微培养板的每个孔中加入 50 μl 细胞裂解液。将数张湿的吸水纸置入一个聚丙烯盒中（如 Tupperware 盒)，再将盛有细胞裂解液和细胞的微培养板放在吸水纸上，用盖封严盒子。
4. 将封好的盒子在 60℃ 温箱中温育 12~16 h。
5. 将盒子移出温箱，取出培养板平放在工作台上，冷却数分钟，每孔加入 100 μl NaCl/乙醇溶液。不用混匀，直接将培养板于室温温育 30 min。温育末期应见到纤维状的核酸沉淀。
6. 缓慢地倒转培养板，将乙醇溶液倒入水池。核酸沉淀应黏附在培养孔的底部。将每个培养板倒置于干燥的吸水纸上，使残余乙醇从培养板流出。
7. 每孔加入 150 μl 70% 乙醇，小心不要移动核酸沉淀。按步骤 6 倒转培养板以去除 70% 乙醇。在吸水纸吸去多余的液体。用 70% 乙醇再冲洗沉淀 2 次。
8. 使培养板在室温干燥直至最后的乙醇挥发。如果基因组 DNA 将用于 PCR 分析，进行步骤 9。如果 DNA 将用于 Southern 杂交，进行步骤 10、11 和 12。
9. 每孔加入 30~50 μl TE ( pH 8.0), 室温缓和地震摇 12~16 h 使 DNA 溶解。
10. 如果 DNA 将用于 Southern 杂交，制备下列限制性内切核酸酶混合物；每孔需 40 μl。
H2O 0.8倍体积
10X限制性内切核酸酶缓冲液 0.1倍体积
无 DNase 的 RNase 10 μg/ml
使用前每 40 μl 混合物加入 10 个单位限制性内切核酸酶。
11. 用多通道移液器在每个孔中加入 40 μl 限制性内切核酸酶反应混合物。反复抽吸数次使孔中内容物混合，小心避免产生气泡。按步骤 3 用 Tupperware 容器制作湿盒, 将培养板放入，使反应在适宜的消化温度温育 12~16 h。
12. 加入 5~10 μl 蔗糖凝胶上样缓冲液终止反应，进行 Southern 印迹和杂交以分析消化的 DNA。
1. 缓冲液和溶液
细胞裂解缓冲液（10 mmol/L Tris-Cl (pH 7.5)，10 mmol/L NaCl，0.5% (m/V) Sarkosyl）
乙醇
NaCl/乙醇溶液
磷酸盐缓冲液（PBS )
蔗糖凝胶上样缓冲液
TE (pH 8.0)
2. 酶和缓冲液
限制性内切核酸酶
无 DNase 的 RNase
3. 专用设备
与带阀门的真空管相连的抽气设备
多通道移液器，8 或 12 道
温箱，预设至 60℃。
振摇平台
Tupperware 容器
4. 细胞和组织
在 96 孔微培养板上生长的细胞
二、方法
1. 用蓝色尖头或者巴斯德移液管吸去 96 孔培养板每个培养孔中的培养液。
只要小心不接触细胞层，通常不用毎个培养孔换新的尖头。
2. 每个培养孔中的细胞用 100 μl 磷酸盐缓冲液冲洗 2 次。
3. 用多通道移液器在微培养板的每个孔中加入 50 μl 细胞裂解液。将数张湿的吸水纸置入一个聚丙烯盒中（如 Tupperware 盒)，再将盛有细胞裂解液和细胞的微培养板放在吸水纸上，用盖封严盒子。
4. 将封好的盒子在 60℃ 温箱中温育 12~16 h。
5. 将盒子移出温箱，取出培养板平放在工作台上，冷却数分钟，每孔加入 100 μl NaCl/乙醇溶液。不用混匀，直接将培养板于室温温育 30 min。温育末期应见到纤维状的核酸沉淀。
6. 缓慢地倒转培养板，将乙醇溶液倒入水池。核酸沉淀应黏附在培养孔的底部。将每个培养板倒置于干燥的吸水纸上，使残余乙醇从培养板流出。
7. 每孔加入 150 μl 70% 乙醇，小心不要移动核酸沉淀。按步骤 6 倒转培养板以去除 70% 乙醇。在吸水纸吸去多余的液体。用 70% 乙醇再冲洗沉淀 2 次。
8. 使培养板在室温干燥直至最后的乙醇挥发。如果基因组 DNA 将用于 PCR 分析，进行步骤 9。如果 DNA 将用于 Southern 杂交，进行步骤 10、11 和 12。
9. 每孔加入 30~50 μl TE ( pH 8.0), 室温缓和地震摇 12~16 h 使 DNA 溶解。
10. 如果 DNA 将用于 Southern 杂交，制备下列限制性内切核酸酶混合物；每孔需 40 μl。
H2O 0.8倍体积
10X限制性内切核酸酶缓冲液 0.1倍体积
无 DNase 的 RNase 10 μg/ml
使用前每 40 μl 混合物加入 10 个单位限制性内切核酸酶。
11. 用多通道移液器在每个孔中加入 40 μl 限制性内切核酸酶反应混合物。反复抽吸数次使孔中内容物混合，小心避免产生气泡。按步骤 3 用 Tupperware 容器制作湿盒, 将培养板放入，使反应在适宜的消化温度温育 12~16 h。
12. 加入 5~10 μl 蔗糖凝胶上样缓冲液终止反应，进行 Southern 印迹和杂交以分析消化的 DNA。
来源：丁香实验
