原理
许多真核生物的基因所包含的 DNA,远非单个重组子所能容纳得了的。对于大多数染色体来说,更是如此。因此,必须构建一套重叠的 DNA 克隆,这些克隆的 DNA 按次序排列能形成叠连序列(叠连群),可以涵盖一个很大的基因或目的区域。
材料与仪器
T4 噬菌体 DNA 连接酶 限制性内切核酸酶 PstⅠ或 NsiⅠ 耐热性 DNA 聚合酶 模板 DNA
扩增缓冲液 dNTP 溶液 乙醇 酚 氯仿 醋酸钠 T4 DNA 连接缓冲液
琼脂糖凝胶 核酸和寡核苷酸 寡核苷酸盒 带过滤层吸头 薄壁微量离心管 移液器 程控式 PCR 仪 水浴或冷却装置
扩增缓冲液 dNTP 溶液 乙醇 酚 氯仿 醋酸钠 T4 DNA 连接缓冲液
琼脂糖凝胶 核酸和寡核苷酸 寡核苷酸盒 带过滤层吸头 薄壁微量离心管 移液器 程控式 PCR 仪 水浴或冷却装置
步骤
一、材料
1. 缓冲液和溶液
10X 扩增缓冲液
dNTP 溶液(1 mmol/L,包括所有 4 种 dNTP ( pH 8.0;PCR 级)
乙醇
酚:氯仿(1:1, V/V)
醋酸钠(3 mol/L, pH 5.2)
10X T4 DNA 连接缓冲液
2. 酶及其缓冲液
T4 噬菌体 DNA 连接酶
限制性内切核酸酶 PstⅠ或 NsiⅠ
耐热性 DNA 聚合酶
3. 凝胶
琼脂糖凝胶
核酸和寡核苷酸
寡核苷酸盒 [ 5.0 OD260/ml (~8.5 μmol/L)],用 TE ( pH 7.6) 溶解 5'CATGCTCGGTCGGGATAGGCACTGGTCTAGAGGGTTAGGTTCCTGC TACATCTCCAGCCT TGCA3'
寡核苷酸(接头)引物 [ 5.0 OD260/ml (~17 μmol/L) ], 用 TE ( pH 7.6 ) 溶解。 5'CATGCTCGGTCGGGATAGGCACTGGTCTAGAG3'
序列特异性寡核苷酸(载体) 引物 [ 5.0 OD260/ml (~17 μmol/L) ]。用 TE ( pH 7.6 ) 溶解。
模板 DNA: 重组 BAC、YAC 或黏粒 DNA
4. 专用设备
自动移液器用的带过滤层吸头
扩增用的薄壁微量离心管(0.5 ml)
阳性对照专用的移液器
储存有扩增程序的程控式 PCR 仪
15℃ 水浴或冷却装置
二、方法
1. 用 PstⅠ或 NsiⅠ消化约 5 μg 模板 DNA。取一小份反应产物,进行琼脂糖凝胶电泳,以确证所有的 DNA 都已经被酶解。
2. 用酚: 氯仿抽提混合液及标准的乙醇沉淀法回收 DNA,然后用 70% 的乙醇洗涤沉淀。将管子开口倒扣在一叠卫生纸巾上,使最后残留的乙醇挥发,然后用 50 μl H2O 溶解湿润的 DNA 沉淀。
3. 在一个无菌的 0.5 ml 的微量离心管中,依次加入下列物质:10X T4 DNA 连接酶缓冲液 10 μl,消化后的 DNA 模板 20 μl,寡核苷酸盒子 5.0 OD260/ml 2 μl,T4 噬菌体 DNA 连接酶 5 Weiss 单位/μl 2 μl,加水至 100 μl。
设 3 个对照管,对照管的体系参照上述配方。其中一个无模板 DNA,另一个无寡核苷酸接头,第 3 个无 T4 DNA 连接酶。
4. 将实验管及对照管在 15℃ 下连接 12~16 h。
5. 在一个无菌的 0.5 ml 的微量离心管中,依次加入下列物质:10X 扩增缓冲液 2 μl,1 mmol/L 4 种 dNTP 混合溶液(pH 7.0) 2 μl,接头的寡核苷酸引物 5.0 OD260/ml 1 μl,载体的寡核苷酸引物 5.0 OD260/ml 1 μl,取自步骤 4 的实验管 DNA 连接产物 1 μl,耐热 DNA 聚合酶 5.0 单位/μl 0.5 μl,加水至 20 μl。
设 3 个 PCR 对照。每只对照管中含有连接反应中相对应的对照反应液 1 μl。
6. 如果 PCR 仪没有高温顶壳,在反应混合体系里加一滴(约 50 μl)轻矿物油,以防止加热和冷却循环时样品的蒸发。另外,如果用热启动则加一滴石蜡。
7. 将 PCR 管放入 PCR 仪中,按下表输入程序后,开始扩增。
8. 将每一管扩增产物都取出一份(25%),用琼脂糖凝胶电泳分析。
1. 缓冲液和溶液
10X 扩增缓冲液
dNTP 溶液(1 mmol/L,包括所有 4 种 dNTP ( pH 8.0;PCR 级)
乙醇
酚:氯仿(1:1, V/V)
醋酸钠(3 mol/L, pH 5.2)
10X T4 DNA 连接缓冲液
2. 酶及其缓冲液
T4 噬菌体 DNA 连接酶
限制性内切核酸酶 PstⅠ或 NsiⅠ
耐热性 DNA 聚合酶
3. 凝胶
琼脂糖凝胶
核酸和寡核苷酸
寡核苷酸盒 [ 5.0 OD260/ml (~8.5 μmol/L)],用 TE ( pH 7.6) 溶解 5'CATGCTCGGTCGGGATAGGCACTGGTCTAGAGGGTTAGGTTCCTGC TACATCTCCAGCCT TGCA3'
寡核苷酸(接头)引物 [ 5.0 OD260/ml (~17 μmol/L) ], 用 TE ( pH 7.6 ) 溶解。 5'CATGCTCGGTCGGGATAGGCACTGGTCTAGAG3'
序列特异性寡核苷酸(载体) 引物 [ 5.0 OD260/ml (~17 μmol/L) ]。用 TE ( pH 7.6 ) 溶解。
模板 DNA: 重组 BAC、YAC 或黏粒 DNA
4. 专用设备
自动移液器用的带过滤层吸头
扩增用的薄壁微量离心管(0.5 ml)
阳性对照专用的移液器
储存有扩增程序的程控式 PCR 仪
15℃ 水浴或冷却装置
二、方法
1. 用 PstⅠ或 NsiⅠ消化约 5 μg 模板 DNA。取一小份反应产物,进行琼脂糖凝胶电泳,以确证所有的 DNA 都已经被酶解。
2. 用酚: 氯仿抽提混合液及标准的乙醇沉淀法回收 DNA,然后用 70% 的乙醇洗涤沉淀。将管子开口倒扣在一叠卫生纸巾上,使最后残留的乙醇挥发,然后用 50 μl H2O 溶解湿润的 DNA 沉淀。
3. 在一个无菌的 0.5 ml 的微量离心管中,依次加入下列物质:10X T4 DNA 连接酶缓冲液 10 μl,消化后的 DNA 模板 20 μl,寡核苷酸盒子 5.0 OD260/ml 2 μl,T4 噬菌体 DNA 连接酶 5 Weiss 单位/μl 2 μl,加水至 100 μl。
设 3 个对照管,对照管的体系参照上述配方。其中一个无模板 DNA,另一个无寡核苷酸接头,第 3 个无 T4 DNA 连接酶。
4. 将实验管及对照管在 15℃ 下连接 12~16 h。
5. 在一个无菌的 0.5 ml 的微量离心管中,依次加入下列物质:10X 扩增缓冲液 2 μl,1 mmol/L 4 种 dNTP 混合溶液(pH 7.0) 2 μl,接头的寡核苷酸引物 5.0 OD260/ml 1 μl,载体的寡核苷酸引物 5.0 OD260/ml 1 μl,取自步骤 4 的实验管 DNA 连接产物 1 μl,耐热 DNA 聚合酶 5.0 单位/μl 0.5 μl,加水至 20 μl。
设 3 个 PCR 对照。每只对照管中含有连接反应中相对应的对照反应液 1 μl。
6. 如果 PCR 仪没有高温顶壳,在反应混合体系里加一滴(约 50 μl)轻矿物油,以防止加热和冷却循环时样品的蒸发。另外,如果用热启动则加一滴石蜡。
7. 将 PCR 管放入 PCR 仪中,按下表输入程序后,开始扩增。
8. 将每一管扩增产物都取出一份(25%),用琼脂糖凝胶电泳分析。
来源:丁香实验