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在凸出末端上连接接头实验

相关实验:在凸出末端上连接接头实验

最新修订时间:

材料与仪器

T4 噬菌体 DNA 连接酶 多聚核苷酸激酶 限制性内切核酸酶
ATP 乙醇 接头激酶缓冲液 苯酚 氯仿 乙酸钠 TE
层析设备 水浴装置

步骤

一、材料

1. 缓冲液和溶液

ATP (10 mmol/L),乙醇,10x 接头激酶缓冲液,苯酚:氯仿(1:1, V/V),乙酸钠(3 mol/L, pH 5.2),TE ( pH 8.0)。

2. 酶及缓冲液

T4 噬菌体 DNA 连接酶,多聚核苷酸激酶,限制性内切核酸酶。

3. 核酸和寡核苷酸

外源或目的 DNA 片段,人工合成的寡核苷酸或接头,用 TE ( pH 8.0) 溶解,终浓度约为 400 ug/ml。

4. 专用设备

层析设备,温度可调至 65℃ 的水浴装置。

二、方法

1. 在一无菌离心管内进行接头的磷酸化:

合成的寡核苷酸或接头 0.5~2.0 ug TE(pH 8.0)溶解,10x 接头激酶缓冲液 1.0 ul,10 mmol/L ATP 1.0 ul,H2O 加至 10 ul,T4 噬菌体 DNA 连接酶 1.0 单位,反应体系置于 37℃ 温育 1 h。

没有必要钝化出磷酸化的接头,因为可在反应混合物中直接进行连接反应。

2. 磷酸化接头与补平的 DNA 片段连接的反应体系如下:

DNA 片段 100~200 ng,磷酸化接头 摩尔数超过 10~20 倍,10x 连接酶缓冲液 1.0 ul,T4 噬菌体 DNA 连接酶 0.1 Weiss 单位,10 mmol/L ATP 1.0 ul,H2O 加至 10 ul,连接混合物于 4℃ 放置 6~16 h。

为获得最大效率的连接,反应体系越小越好,一般为 5~10 μl。在反应混合物中,ATP 作为 10X 连接缓冲液的组分,可为载体和外源 DNA 片段的体积提供更大的空间。有些厂家的连接缓冲液中已含有 ATP, 这样在应用时就不必另加 ATP 了。

3. 65℃ 温育连接反应混合物 15 min, 以灭活 DNA 连接酶。

4. 用 10 ul 适当的 10x 限制酶缓冲液稀释连接产物。补加蒸馏水使终体积 100 ul 中含有 50~100 单位的限制酶。

5. 反应体系于 37℃ 温育 1~3 h。

限制酶可从 DNA 片段的末端上除去多聚合体,并形成凸出末端。在反应体系中有大量接头存在,需要用大量限制酶来消化。

6. 用苯酚:氯仿抽提反应混合物一次,然后用乙醇沉淀回收 DNA。

7. 于 4℃ 用微量离心机以最大速度离心 15 min 以收集 DNA 沉淀,用 50 ul TE ( pH 8.0) 重新溶解 DNA 沉淀。

8. 将获得的 DNA 溶液过层析柱,以去除过量的接头及酶切小片段。

9. 经修饰的 DNA 片段现在可被用于与带凸出末端的质粒 DNA 连接。

来源:丁香实验

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