原理
将细胞悬液加入到圆形培养瓶中，然后将培养瓶放在旋转架上缓慢转动。
材料与仪器
D-PBSA 0.25%天然胰蛋白酶 单层细胞 二氧化碳
培养液和培养液容器 旋转培养瓶 血细胞计数板或电子细胞计数器和计数用液体 旋转架
培养液和培养液容器 旋转培养瓶 血细胞计数板或电子细胞计数器和计数用液体 旋转架
步骤
1. 用胰蛋白酶消化细胞，以通常密度种植。
旋转瓶中的气相较大， 故用基于 Hanks 盐和空气气相的培养基，可能需要向培养瓶内充入少量 5% CO2 （如 10 L/min，2 s）。如果培养液是用 CO2/HCO3 缓冲的， 气相应该用 5% CO2 调整（20 L/min，30s~1 min，以瓶的大小决定）。
2. 将培养瓶放在旋转架上，以 20 rph 的速度转动，直至细胞贴壁（24~48 h ) 。
3. 细胞密度增大时，加快旋转速度至 60~80 rph。
4. 给细胞加培养液或收集培养液时，可将培养瓶取到无菌工作区，如通常一样排出培养液，然后更换新鲜培养液。假如体积不是关键问题，输血装置或培养液袋对于添加新鲜培养液是有用的。如果培养液容量至关重要，可用吸管滴加或用一个蠕动泵计量。
5. 收获细胞：
(a)弃去培养液，用 50~100 ml D-PBSA 浸洗细胞，然后弃去 D-PBSA。
(b)在 4℃条件下，加入 50~100 ml 胰蛋白酶。用手或放在旋转架上以 20 rpm 将培养瓶转动 15 s。
(c)吸出胰蛋白酶，将培养瓶内的细胞消化 5~15 min，然后加入培养液。
(d)摇晃和转动培养瓶，用滴管将细胞洗出。
旋转瓶中的气相较大， 故用基于 Hanks 盐和空气气相的培养基，可能需要向培养瓶内充入少量 5% CO2 （如 10 L/min，2 s）。如果培养液是用 CO2/HCO3 缓冲的， 气相应该用 5% CO2 调整（20 L/min，30s~1 min，以瓶的大小决定）。
2. 将培养瓶放在旋转架上，以 20 rph 的速度转动，直至细胞贴壁（24~48 h ) 。
3. 细胞密度增大时，加快旋转速度至 60~80 rph。
4. 给细胞加培养液或收集培养液时，可将培养瓶取到无菌工作区，如通常一样排出培养液，然后更换新鲜培养液。假如体积不是关键问题，输血装置或培养液袋对于添加新鲜培养液是有用的。如果培养液容量至关重要，可用吸管滴加或用一个蠕动泵计量。
5. 收获细胞：
(a)弃去培养液，用 50~100 ml D-PBSA 浸洗细胞，然后弃去 D-PBSA。
(b)在 4℃条件下，加入 50~100 ml 胰蛋白酶。用手或放在旋转架上以 20 rpm 将培养瓶转动 15 s。
(c)吸出胰蛋白酶，将培养瓶内的细胞消化 5~15 min，然后加入培养液。
(d)摇晃和转动培养瓶，用滴管将细胞洗出。
来源：丁香实验
