哺乳动物细胞总RNA快速分离

尤钙镁离子磷酸缓冲盐溶液 EDTA SDS 乙酸钠 水平衡的苯酚 乙醇 Tris-Cl NaCL

一 材料与设备

1)尤钙镁离子磷酸缓冲盐溶液 (PBS)
    
2)10 mmol/L  EDTA (pH8.0 )
    
3)0.5% SDS  
 
4)0. l mol/L 乙酸钠（pH 5.2 )   

5)水平衡的苯酚   

6)乙醇  

7)l mol/L Tris-Cl (pH8.0 )     

8)5 mol/L NaCL


二 操作方法

1 ) 吸出培养液，用 7m l 冰预冷的无钙镁离子磷酸缓冲盐溶液 ( PBS) 冲洗细胞培养皿内的单层细胞，重 复1 次.操 作 时 ，应将平板置于冰上，直至所有单层细胞冲洗完毕。

2 ) 每个直径 90mm 培 养皿中加 2ml 10mmol/L EDTA(pH8.0 ) 、0. 5% SDS，用刮棒将裂解物刮入一次性使用的 15m l 离心管中。

3 ) 用 2ml 0. 1mol/L 乙酸钠 （pH5. 2 )、10mmol./L EDTA( PH8. 0 ) 冲洗平板，并将冲洗液移至上述装有细胞裂解物的离心管屮。

4 ) 将 4m l 水平衡的苯酚，于室温振荡 2mm，使之与细胞裂解物混匀，则细胞 DNA 形成白色丝状沉淀。

5 )于 4 ℃ 以 5000r/ mm 离心 10mm 分相 ，两相之间可见致密的 DNA 层 。

6 ) 用一支巴斯德吸管将上层 (水相）移至另一个 装 有 440u1 冰 预 冷 的 lmol/L Tris-Cl( pH8. 0) 和 180ul 5mol/L NaCl  的离心管中。

7 ) 加 2 倍体积冰预冷的乙醇，混勻 ，于 0°C放置至少 30min

8 ) 于 4°C 以 5000r/mim 离 心 l0min 以沉淀 RNA，弃去乙 醇 ，离心管直立倒置直至所有乙醇挥发殆尽。

9 ) 用 200ul 冰预冷的 TE（pH8. 0 )重溶 RNA, 将其移至一个灭菌的微量离心管内，并加5mol/L NaCl、50ul 冰预冷的乙醇，

1 0 ) 用微量离心机于 4°C 以 12000 足离心 5min 以收集 RNA,

11)吸出所有的乙 醇 ，将打开管盖的离心管置于实验台上放几分钟，让最后残留的痕量乙醇挥发殆尽。

1 2 )用所需缓冲液重溶 RNA。