原理
温度高时琼脂呈液态，但在37℃ 时成凝胶状态，细胞悬浮在温暖的琼脂凝胶培养基中，待琼脂形成凝胶后进行培养，形成散在集落，很容易分离。
材料与仪器
Noble琼脂 Difco 胎牛血清
两倍浓度培养基 生长培养基 无菌超纯水 无菌锥形瓶 吸管 通用容器 培养皿 水浴 三角瓶 托盘 电子细胞计数仪 本生煤气喷灯
两倍浓度培养基 生长培养基 无菌超纯水 无菌锥形瓶 吸管 通用容器 培养皿 水浴 三角瓶 托盘 电子细胞计数仪 本生煤气喷灯
步骤
1. 在培养皿底皿侧面编号或做好标记，将培养皿放在托盘中，很方便。
2. 准备含 40 % FBS 的 2× 培养基（即 Ham’SF12、RPMI1640、DMEM 或 CMRL1066。用 10×培养基配 2× 培养基，取半量所需终液量，加两倍浓度的血清），保持 37℃。
3. 称取 1.2 g 琼脂。
4. 分别在无菌锥形瓶和另一个无菌瓶中加 100 ml 无菌 UPW。将 1.2 g 琼脂放人锥形瓶中，盖好，煮沸 2 min 。另一种方法是，提前高温灭菌琼脂。但若已保存起来，使用时仍需煮沸溶解或微波炉融化备用。
5. 将煮沸过的琼脂和有 UPW 的瓶放到 55°C 水浴中。
6. 2× 培养基和 1.2 % 琼脂等量混合制备 0.6 % 琼脂底层，保持 37°C 。如果需要任何的生长因子、激素或其他添加物，应在此时添加至底层琼脂培养基（生长培养基，1×，用于细胞稀释）内。
7. 在培养皿中加人 1 ml 0.6 % 的琼脂培养基，晃匀，确保培养基覆盖整个培养皿底。置于室温定型。
8. 制备细胞悬液，计数。
9. 准备 0.3% 琼脂培养基，保持 37°C 。此培养基可以用 37°C 的 2× 培养基、55°C 的 1.2 % 琼脂和 55°C 的 UPW 以 2:1:1 的比例混合制备。
10. 制备以下稀释浓度的细胞，使细胞的最大浓度为 1×105 /ml。
(a)1×105 /ml
(b)将 1×105 /ml 稀释 3 倍成 3.3×104 /ml
(c)将 3.3×104 /ml 稀释 3 倍成 1.1×104 /ml
(d)将 1.1×104 /ml 稀释 3 倍成 3.7×103 /ml
11. 将四种稀释液的浓度分别标在 4 个小玻璃瓶或试管上，从每种稀释液中吸出 40 μl，包括 1×105 /ml 细胞液，分别放入相应容器内 37°C 加 4 ml 0.3% 琼脂培养基，混匀，再从每个容器（通用容器，小玻璃瓶或离心管，稀释细胞用）中吸出 3 个 1 ml 分别加在相应的三个培养皿上。最终浓度如下：
(a)1×103 /ml/皿
(b)330 /ml/皿
(c)110 /ml/皿
(d)37 /ml/皿
加细胞之前， 确保上层琼脂培养基有足够的时间冷却至 37°C 。
12. 待培养皿中的溶液在室温下形成凝胶状态。
13. 将培养皿放置在一个带盖的清洁塑料盒中，37°C 加湿温箱中培养 10 天。
2. 准备含 40 % FBS 的 2× 培养基（即 Ham’SF12、RPMI1640、DMEM 或 CMRL1066。用 10×培养基配 2× 培养基，取半量所需终液量，加两倍浓度的血清），保持 37℃。
3. 称取 1.2 g 琼脂。
4. 分别在无菌锥形瓶和另一个无菌瓶中加 100 ml 无菌 UPW。将 1.2 g 琼脂放人锥形瓶中，盖好，煮沸 2 min 。另一种方法是，提前高温灭菌琼脂。但若已保存起来，使用时仍需煮沸溶解或微波炉融化备用。
5. 将煮沸过的琼脂和有 UPW 的瓶放到 55°C 水浴中。
6. 2× 培养基和 1.2 % 琼脂等量混合制备 0.6 % 琼脂底层，保持 37°C 。如果需要任何的生长因子、激素或其他添加物，应在此时添加至底层琼脂培养基（生长培养基，1×，用于细胞稀释）内。
7. 在培养皿中加人 1 ml 0.6 % 的琼脂培养基，晃匀，确保培养基覆盖整个培养皿底。置于室温定型。
8. 制备细胞悬液，计数。
9. 准备 0.3% 琼脂培养基，保持 37°C 。此培养基可以用 37°C 的 2× 培养基、55°C 的 1.2 % 琼脂和 55°C 的 UPW 以 2:1:1 的比例混合制备。
10. 制备以下稀释浓度的细胞，使细胞的最大浓度为 1×105 /ml。
(a)1×105 /ml
(b)将 1×105 /ml 稀释 3 倍成 3.3×104 /ml
(c)将 3.3×104 /ml 稀释 3 倍成 1.1×104 /ml
(d)将 1.1×104 /ml 稀释 3 倍成 3.7×103 /ml
11. 将四种稀释液的浓度分别标在 4 个小玻璃瓶或试管上，从每种稀释液中吸出 40 μl，包括 1×105 /ml 细胞液，分别放入相应容器内 37°C 加 4 ml 0.3% 琼脂培养基，混匀，再从每个容器（通用容器，小玻璃瓶或离心管，稀释细胞用）中吸出 3 个 1 ml 分别加在相应的三个培养皿上。最终浓度如下：
(a)1×103 /ml/皿
(b)330 /ml/皿
(c)110 /ml/皿
(d)37 /ml/皿
加细胞之前， 确保上层琼脂培养基有足够的时间冷却至 37°C 。
12. 待培养皿中的溶液在室温下形成凝胶状态。
13. 将培养皿放置在一个带盖的清洁塑料盒中，37°C 加湿温箱中培养 10 天。
注意事项
准备培养基和细胞之前，先算出细胞稀释度，在培养皿上做好标记，检测一个细胞系的克隆形成率时，为每种稀释度的细胞分别准备3 个培养皿。每个3. 5 cm 培养皿适宜接种的细胞數是1000、333、111和 37 个。也就是依次 3 倍的稀释细胞悬液。如果需要加入生长因子、激素或其他添加剂，应加在下层的 0.6 % 琼脂中。
常见问题
如果需要测定生长因子的活性滴度或选择不同因子，在铺底层琼脂之前向培养皿内加入所需量的因子。
来源：丁香实验
