方案14.3 饲养层的准备

接种同源或异源细胞—比如来自小鼠胚胎的细胞。待受测细胞克隆培养之前，中等密度，用射线照射或药物作用使其失去增殖能力。

第二代13天胎龄小鼠胚胎成纤维细胞 丝裂霉素C
克隆培养用培养基 X射线或6GCo源

1. 用胰蛋白酶消化原代培养的胚胎成纤维细胞（见方案 12.6、方案 13.2），以每毫升 10⁵ 个细胞再种入培养瓶中。

2. 用以下其中之一的方法阻止进一步分裂：



(a)通过放射处理

i)原培养瓶中，细胞暴露于 60 Gy 照射细胞，用 X-光机或 γ 射线源 如 ⁶⁰Co（X 射线或 ⁶⁰Co源，能在 30 min 或更短时间内释放 30 Gy （可以取代丝裂霉素C））。

ii)消化后细胞悬液，细胞暴露于 60 Gy 照射细胞，用 X-光机或 γ 射线源 如 ⁶⁰Co。然后以 1×10⁵ ml 接种，或将照射过的细胞保存在 4°C，最长到 5 天。

(b)通过丝裂霉素 C （丝裂霉素C，100 μg/ml 储存液，溶于 HBSS 或无血清培养基中）处理

i)以 0.25 μg/ml 将丝裂霉素加到接近汇合的细胞中，37°C 过夜（~18 h ）[ Macpherson and Bryden，1971 ]，更换培养基。

ii)胰蛋白酶消化悬液 1×10⁷ ml 中加人丝裂霉素 C，终浓度 20 μg/ml（相当于2 μg/10⁶ 个细胞），37°C 孵育 1 h ，离心清洗（4×10 ml） 去除丝裂霉素，再以 1×10⁵ /ml 接种 [Stanley，2002 ] 或 4°C 保存，可到 5 天。

3. 再培养 24~72 h 后，胰蛋白酶消化，再接种在新的培养基中。或直接接种保存的细胞。接种浓度 5×10⁴ 个细胞 /m l （10⁴ 个细胞 /cm²）。

4. 继续培养 24~48 h，种入克隆培养的细胞。