方案21.11 3H-胸腺嘧啶脱氧核苷的标记指数实验

细胞培养至适当密度，用¹H -胸腺嘧啶脱氧核苷标记 30min，清洗后固定细胞，除去未掺入的前体物，准备同位素放射自显术。

材料

无菌

培养细胞
生长液
0.25% 粗制胰蛋白酶
D-PBSA
³H-胸腺嘧啶脱氧核苷，2.0MBq/ml (约 50uCi/ml)，75 GBq/mmol (约 2Ci/mmol)
安全提示 处理 ³H-胸腺嘧啶脱氧核苷时要谨慎， 因为它是放射活性物质和基因产物！要遵照当地指南操作（见 7.7 节）。
多孔培养板，内含 13 mmThermanox 盖片（Nalge Nunc)

非无菌

血球计数板或电子计数器
D-PBSA
醋酸甲醇（1 份冰醋酸加入 3 份甲醇），冰冷，新鲜配制
显微镜载片
封胶（如 DPX 或 Permount)
三氯乙酸（TCA ),0.6mol/L ，冰冷
去离子水
甲醇

操作步骤

1. 在装有盖片的 24 孔培养板中，以 2X10⁴～5X10⁴ 个/ml 培养细胞。

2. 待细胞贴壁，开始增殖（48～72 h) , 让其达到所需要的细胞密度。

3. 在培养液中加入 ³H -胸腺嘧啶脱氧核苷，100KBq/ml(约 5uCi/ml)，将细胞继续培养 30 min 。

提示 某些培养基，例如 Ham’s F10 和 F12，它们含有胸腺嘧啶脱氧核苷 (表 9.3，10.1 和 10.2)，那么放射活性的胸腺嘧啶脱氧核苷的浓度要增加，这样方能在培养液内达到相同的特异活性。

4. 除去标记液体，将它弃于专用的放射废物容器中。

5. 用 D-PBSA 清洗盖片 3 次。每冲洗一次，要从孔底部揭起盖片（但不要超出该孔），以便使盖片底部的同位素能冲掉。

6. 加人 1:1 的 D-PBSA : 醋酸甲醇，每孔 lml，然后立即吸去。

7. 每孔加人 lml 冰醋酸（4℃ )，静止 l0 min。

8. 取出盖片，用风扇吹干。

9. 将盖片封固于显微镜载片上，细胞面朝上。

10. 让封固胶过夜干燥。

11. 将载片放在含 0.6mol/L TCA 的染色缸中（4°C)，静置 lO min，在此过程中更换 2 次 TCA，借此可除去未掺人的前体物。

12. 用去离子水淋洗，然后改用甲醇，晾干。

13. 准备放射自显术（见方案 27.3. )。

14. 当放射自显影进行一段曝光时间（通常 1～2 个星期），显影，染色（见方案 27.3),40 倍显微镜下观察。

15. 计数标记细胞的百分比。为了涵盖代表区，按图 21.14 所示进行扫描观察。