原理
材料与仪器
步骤
材料
无菌:细胞培养物、D-PBSA、0. 2 5 % 粗制胰蛋白酶、生长培养基
非无菌:计数杯
操作步骤
1. 用胰酶消化单层培养的细胞,或从悬浮培养中收集样品。充分地混匀细胞悬液使之尽量分散成单个细胞。
2. 在一个 25m l 的烧杯或任一样品杯中,用计数液体以 1 : 50 稀释细胞悬液至 20m l。使用自动分散器(图 5. 2 0 ) 会加速稀释,会使重复性更好。
注意事项 快速地分配计数溶液会产生气泡,当这些气泡通过小孔时会被当作细胞统计在内。因而计数溶液在开始计数前应静置一会儿。如果溶液被先分配,然后再加入细胞,则出现气泡的可能性就会很小。
3 . 充分地混匀细胞悬液,然后移入带孔管子的底部,确保能覆盖住小孔,样品杯中的外部电极应位于计数溶液的液面之下。
4 . 检査程序设置:
(a) 临界值设定(细胞大小的下限通常为 7. 0um );
(b ) 检测体积(通常 0.5 ml);
(c) 背景去除(视需要而定);
(d ) 溶解设定(例如,若 20 ml 的 D-PBSA 中有 0.4 ml 被计数,则设为 50)。
5. 检査可见的模拟显示
(a) 确保所有的细胞都在设定的临界范围之内;
(b ) 检査细胞活力或细胞碎片(通过曲线的肩部或正常临界值下限以下的直方图来指示)。
(c) 检査细胞是否聚集成团(即出现在正常大小范围之上的颗粒)。
6 . 启动计数程序。
7 . 当计数周期完成时,细胞大小的分布情况将出现在模拟显示屏上(图 21.4)。 转换到数字显示屏后就可以得到每毫升的细胞数。
来源:丁香实验