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植物体内可溶性蛋白和非可溶性蛋白含量的测定实验

相关实验:植物体内可溶性蛋白和非可溶性蛋白含量的测定实验

最新修订时间:

原理

植物材料经Tris-HCl缓冲液研磨、离心后,可溶性蛋白质溶于上清液中,非可溶性蛋白则存在于沉淀部分。将沉淀用碱水解,则会得到非可溶性蛋白的提取液。蛋白质提取液与考马斯亮蓝G-250反应呈蓝色。在一定范围内,蛋白质的含量与反应液在595nm波长的吸光度呈正比,由此可求出蛋白质的含量。

材料与仪器

植物叶片
考马斯亮蓝溶液 HCl MgCl2 EDTA 二硫苏糖醇 牛血清蛋白标准母液
高速冷冻离心机 分光光度计 恒温水浴 研钵 试管 移液管 洗耳球

步骤

1. 牛血清蛋白标准曲线的制作

(1)取6支试管,编号,按下表配制每管含量为0~100μg的牛血清蛋白标准液。

加入表中试剂后,摇匀,以0号管为空白对照,在595nm波长处测定其吸光度(A)值。


(2)标准曲线绘制

以牛血清蛋白含量为横坐标,吸光度值为纵坐标,绘制标准曲线。

2. 蛋白质的提取

称取叶片0.3~0.5g,剪碎于冷冻过的研钵中加提取液3 ml,加少量石英砂,在冰浴中快速研磨成匀浆,匀浆倒入离心管中,再用5 ml提取液(分两次)将研钵中匀浆洗入离心管,然后在10000 r/ min,4℃条件下离心20min,上清液即为可溶性蛋白质提取液。

将离心所得的沉淀加3 ml 1mol·L-1NaOH溶液,在90℃恒温水浴中加热20min后,在4000 r / min,4℃条件下离心10min,上清液即为非可溶性蛋白质提取液。

3. 测定

上述两种上清液各取0.1 ml分别放入2支试管中,每管再加Tris缓冲液0.9 ml,空白对照管加Tris缓冲液1 ml,然后各管分别再加入考马斯亮蓝染色液5 ml,摇匀,在595nm波长处测定吸光度(A)值。

五、结果计算

根据所测得的样品液吸光度值,从标准曲线查出蛋白质含量,按下公式计算可溶性蛋白质和非可溶性蛋白质含量。


来源:丁香实验

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