原理
植物材料经Tris-HCl缓冲液研磨、离心后,可溶性蛋白质溶于上清液中,非可溶性蛋白则存在于沉淀部分。将沉淀用碱水解,则会得到非可溶性蛋白的提取液。蛋白质提取液与考马斯亮蓝G-250反应呈蓝色。在一定范围内,蛋白质的含量与反应液在595nm波长的吸光度呈正比,由此可求出蛋白质的含量。
材料与仪器
植物叶片
考马斯亮蓝溶液 HCl MgCl2 EDTA 二硫苏糖醇 牛血清蛋白标准母液
高速冷冻离心机 分光光度计 恒温水浴 研钵 试管 移液管 洗耳球
考马斯亮蓝溶液 HCl MgCl2 EDTA 二硫苏糖醇 牛血清蛋白标准母液
高速冷冻离心机 分光光度计 恒温水浴 研钵 试管 移液管 洗耳球
步骤
1. 牛血清蛋白标准曲线的制作
(1)取6支试管,编号,按下表配制每管含量为0~100μg的牛血清蛋白标准液。
加入表中试剂后,摇匀,以0号管为空白对照,在595nm波长处测定其吸光度(A)值。
(2)标准曲线绘制
以牛血清蛋白含量为横坐标,吸光度值为纵坐标,绘制标准曲线。
2. 蛋白质的提取
称取叶片0.3~0.5g,剪碎于冷冻过的研钵中加提取液3 ml,加少量石英砂,在冰浴中快速研磨成匀浆,匀浆倒入离心管中,再用5 ml提取液(分两次)将研钵中匀浆洗入离心管,然后在10000 r/ min,4℃条件下离心20min,上清液即为可溶性蛋白质提取液。
将离心所得的沉淀加3 ml 1mol·L-1NaOH溶液,在90℃恒温水浴中加热20min后,在4000 r / min,4℃条件下离心10min,上清液即为非可溶性蛋白质提取液。
3. 测定
上述两种上清液各取0.1 ml分别放入2支试管中,每管再加Tris缓冲液0.9 ml,空白对照管加Tris缓冲液1 ml,然后各管分别再加入考马斯亮蓝染色液5 ml,摇匀,在595nm波长处测定吸光度(A)值。
五、结果计算
根据所测得的样品液吸光度值,从标准曲线查出蛋白质含量,按下公式计算可溶性蛋白质和非可溶性蛋白质含量。
(1)取6支试管,编号,按下表配制每管含量为0~100μg的牛血清蛋白标准液。
加入表中试剂后,摇匀,以0号管为空白对照,在595nm波长处测定其吸光度(A)值。
(2)标准曲线绘制
以牛血清蛋白含量为横坐标,吸光度值为纵坐标,绘制标准曲线。
2. 蛋白质的提取
称取叶片0.3~0.5g,剪碎于冷冻过的研钵中加提取液3 ml,加少量石英砂,在冰浴中快速研磨成匀浆,匀浆倒入离心管中,再用5 ml提取液(分两次)将研钵中匀浆洗入离心管,然后在10000 r/ min,4℃条件下离心20min,上清液即为可溶性蛋白质提取液。
将离心所得的沉淀加3 ml 1mol·L-1NaOH溶液,在90℃恒温水浴中加热20min后,在4000 r / min,4℃条件下离心10min,上清液即为非可溶性蛋白质提取液。
3. 测定
上述两种上清液各取0.1 ml分别放入2支试管中,每管再加Tris缓冲液0.9 ml,空白对照管加Tris缓冲液1 ml,然后各管分别再加入考马斯亮蓝染色液5 ml,摇匀,在595nm波长处测定吸光度(A)值。
五、结果计算
根据所测得的样品液吸光度值,从标准曲线查出蛋白质含量,按下公式计算可溶性蛋白质和非可溶性蛋白质含量。
来源:丁香实验