原生质等电点测定实验

原生质的主要组成物质──蛋白质为两性化合物，它在不同pH的介质中，其解离情况不同：

（1）在酸性介质中：

（2）在碱性介质中：

当介质的pH值愈小时，此物质的解离就趋向于（1）式，反之则趋向于（2）式，若在某一pH值下，此物质的解离程度达到平衡，这些外界介质的pH即为此物的等电点。

不同的植物组织，由于它们原生质不尽相同，所以具有不同的等电点。欲测植物细胞或组织的等电点，可采用染色法进行。

一般采用酸碱性不同的染料作为指示剂，常用的酸性染料有苯胺红、曙红等，这些染料的有色部分为阴离子；碱性染料有亚甲兰，靛兰等，亚甲兰（Methylene blue）分子式为：

它的有色部分为阳离子。

将待测的植物组织放入苯胺红和亚甲兰的混合溶液中，当介质的pH值低于组织的等电点时，带正电荷的原生质便吸附酸性染料的有色部分而显玫瑰红色；当介质的pH值高于组织的等电点时，带负电荷的原生质便吸附碱性染料的有色部分而呈兰色；当介质的pH值与组织的等电点相等时，原生质的着色反应为红与兰的混合色──紫色。

植物组织的等电点并不固定在一个数值上，而是具有一定范围，常把这个范围称为植物组织的“等电区”。本实验则是根据上述原理测定植物组织的等电点。

柠檬酸溶液 Na2HPO4 溶液 苯胺红溶液 亚甲兰溶液
移液管 刀片 小培养皿 小烧杯 毛笔 镊子 粗滤纸

一、材料与设备

四季豆黄化幼苗，蚕豆幼苗

5 ml 及1 ml 移液管、刀片、小培养皿、小烧杯、毛笔、镊子、粗滤纸

0.1 M柠檬酸溶液、0.2 M Na2HPO4 溶液、0.1％ 苯胺红溶液、0.1％ 亚甲兰溶液

实验步骤

1．依下表配制不同pH的缓冲液，用不同pH的缓冲液按以下比例配制5 ml 混合染料，4 ml 缓冲液+0.5 ml 0.1％苯胺红+0.5 ml 0.1％亚甲兰溶液，分别盛在小培养皿中。

2．取四季豆幼苗胚茎小段，作徒手切片 36 片用70％酒精固定 5 分钟，然后分别取出6片放入各个缓冲液的混合染料中染色20－30 分钟。倾去染料，立即加入相应pH的缓冲液5ml，浸泡（以浸没组织为限），一小时后，观察各个缓冲液中的制片颜色的变化。取在等电区附近的制片，在光镜下观察，精确地比较植物组织的等电点。

本实验中的酸性染料亦可采用曙红，若用曙红进行染色时，不必配制不同pH值的缓冲液的混合染料，可直接取染色液（浓度有0.01 M ）等量混合，进行染色20－30分钟，然后将切片取出分别浸入相应pH的缓冲液内浸泡，半小时后，便可以取出切片鉴别组织的等电区。