原理
毛细管电泳(capillary electrophoresis, CE):以高压电场为驱动力,以电解质为电泳介质,以毛细管为分离通道,样品组分依据淌度和分配行为的差异而实现分离的一种色谱方法。由于毛细管内径小,表面积和体积的比值大,易于散热,因此毛细管电泳可以减少焦耳热的产生,这是CE和传统电泳技术的根本区别。它有多种分离模式,可以采用液相色谱中的各种检测方法。CE既可以分离带电荷的溶质,也可以通过毛细管胶束电动色谱等分离模式分析中性溶质,CE的高分离效率、高检测灵敏度,样品用量极少等特点使它在生物医药样品的分析中显示出突出的优越性。
硝基苯酚是弱酸性物质,其邻、间、对位异构体由于pKa值不同,在一定pH值的缓冲溶液中电离程度不同。因此,它们在毛细管电泳分离过程中表现出不同的迁移速度,从而实现分离。
硝基苯酚是弱酸性物质,其邻、间、对位异构体由于pKa值不同,在一定pH值的缓冲溶液中电离程度不同。因此,它们在毛细管电泳分离过程中表现出不同的迁移速度,从而实现分离。
材料与仪器
步骤
1.打开毛细管电泳仪,预热至检测器输出信号稳定。
2.准确测量毛细管长度。距毛细管一端约15cm处去除约2mm的毛细管聚合物保护层,作为检测窗口,并测量毛细管进样端到检测窗的长度。
3.将毛细管的检测窗口对准检测器光路,并安装好毛细管。
4.依次用氢氧化钠溶液(1.0mol·L-1)、二次蒸馏水、盐酸溶液(0.1mol·L-1)、二次蒸馏水冲洗毛细管各5min,最后在毛细管注入缓冲溶液,并将毛细管的两端分别插入位于电极处的缓冲溶液瓶中。将直流电压调至20kV。
5.待记录仪基线稳定后,关闭高压电源,用压力进样方式进样,并设定进样时间,待样品峰出现后记录其迁移时间,混合样按同样步骤进行操作,并记录图谱。
6.改变外加电压(如15kV或25kV)重复步骤4、5。
7.实验完毕后,关闭仪器电源,并用二次蒸馏水冲洗毛细管。
2.准确测量毛细管长度。距毛细管一端约15cm处去除约2mm的毛细管聚合物保护层,作为检测窗口,并测量毛细管进样端到检测窗的长度。
3.将毛细管的检测窗口对准检测器光路,并安装好毛细管。
4.依次用氢氧化钠溶液(1.0mol·L-1)、二次蒸馏水、盐酸溶液(0.1mol·L-1)、二次蒸馏水冲洗毛细管各5min,最后在毛细管注入缓冲溶液,并将毛细管的两端分别插入位于电极处的缓冲溶液瓶中。将直流电压调至20kV。
5.待记录仪基线稳定后,关闭高压电源,用压力进样方式进样,并设定进样时间,待样品峰出现后记录其迁移时间,混合样按同样步骤进行操作,并记录图谱。
6.改变外加电压(如15kV或25kV)重复步骤4、5。
7.实验完毕后,关闭仪器电源,并用二次蒸馏水冲洗毛细管。
常见问题
1.根据所得到的实验数据,计算电渗速度、电渗淌度、各组分的电泳淌度、间硝基苯酚的理论塔板数。根据分离图计算各组分之间的分离度。
2.绘制外加电压与电渗速度的关系图,并给予解释。
2.绘制外加电压与电渗速度的关系图,并给予解释。
来源:丁香实验