研磨法

蔗糖酶( inver tase ) (β-D-呋喃果糖苷果糖水解酶) ( fructofuranosidefructohydrolase ) ( EC. 3 . 2 . 1 . 26 ) 特异地催化非还原糖中的α-呋喃果糖苷键水解, 具有相对专一性。不仅能催化蔗糖水解生成葡萄糖和果糖, 也能催化棉子糖水解, 生成密二糖和果糖。

啤酒酵母中含有大量的蔗糖酶, 通过研磨破细胞壁, 使酶游离出来, 用水萃取酶, 然后用有机溶剂沉淀酶蛋白得到粗制品,还可用柱层析进一步纯化得到精制品。

1.  提取
 

（1）准备一个冰浴, 将研钵稳妥地放入冰浴中。
 

（2）称取10 g 湿啤酒酵母, 和适量( 约5 g) 二氧化硅一起放入研钵中。二氧化硅要预先研细。

 

（3）缓慢加入预冷的30 ml 去离子水, 每次加2 ml 左右, 边加边研磨, 至少用30 分钟。至酵母细胞大部分研碎, 以便将蔗糖酶充分转入水相。

 

（4）(可选项) 研磨时用显微镜检查研磨的效果。
 

（5）将混合物转入两个离心管中, 平衡后, 用高速冷冻离心机离心, 4 ℃ , 10 000 r/ min , 离心15 min。

 

（6）用滴管小心地取出水相, 转入另一个清洁的离心管中,4 ℃ , 10 000 r/ min , 离心15 min。

 

（7）将上清液转入量筒, 量出体积。用广泛pH 试纸检查上清液pH, 用1 mol/ L 乙酸将pH 调至5.0 , 称为级分I。留出1.5 ml 测定酶活力及蛋白含量, 剩余部分转入清洁离心管中。

2.  热处理和乙醇沉淀
 

（1）预先将恒温水浴调到50 ℃ , 将盛有级分Ⅰ 的离心管稳妥地放入水浴中, 50 ℃下保温30 分钟, 在保温过程中不断轻摇离心管。

 

（2）取出离心管, 于冰浴中迅速冷却, 4 ℃ , 10 000 r/ min ,离心10 min。

 

（3）将上清液转入小烧杯中, 放入冰盐浴( 没有水的碎冰撒入少量食盐) , 缓慢地加入等体积预冷至- 20 ℃的95%乙醇, 同时轻轻搅拌, 再在冰盐浴中放置10 分钟, 以沉淀完全。于4 ℃ ,10 000 r/ min , 离心10 min , 倾去上清液, 并滴干, 沉淀保存于离心管中, 盖上盖子或薄膜封口, 然后将其放入冰箱中冷冻保存(称为 级分Ⅱ)。