降落 PCR

基于PCR原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点。在标准反应中采用三温度点法，双链DNA在90～95℃变性，再迅速冷却至40 ～60℃，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至70～75℃，在Taq DNA 聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸。对于较短靶基因(长度为100～300bp时)可采用二温度点法， 除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一，一般采用94℃变性，65℃左右退火与延伸(此温度Taq DNA酶仍有较高的催化活性)。

　　①变性温度与时间：变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的最主要原因。一般情况下，93℃～94℃lmin足以使模板DNA变性，若低于93℃则需延长时间，但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全变性，就会导致PCR失败。

　　②退火(复性)温度与时间：退火温度是影响PCR特异性的较重要因素。变性后温度快速冷却至40℃～60℃，可使引物和模板发生结合。由于模板DNA 比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度。对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引物，55℃为选择最适退火温度的起点较为理想。引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度：

　　　　　Tm值(解链温度)=4(G+C)＋2(A+T)

　　　　　复性温度=Tm值-(5～10℃)

在Tm值允许范围内， 选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合， 提高PCR反应的特异性。复性时间一般为30～60sec，足以使引物与模板之间完全结合。

③延伸温度与时间：Taq DNA聚合酶的生物学活性：

　　　　　　　　　70～80℃ 150核苷酸/S/酶分子

　　　　　　　　　70℃ 60核苷酸/S/酶分子

　　　　　　　　　55℃ 24核苷酸/S/酶分子

　　　　　　　　　高于90℃时， DNA合成几乎不能进行。

PCR反应的延伸温度一般选择在70～75℃之间，常用温度为72℃，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。PCR延伸反应的时间，可根据待扩增片段的长度而定，一般1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min是足够 的。3～4kb的靶序列需3～4min；扩增10Kb需延伸至15min。延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现。对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。

　　循环次数　　循环次数决定PCR扩增程度。PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度。一般的循环次数选在30～40次之间，循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多。

基因样品
引物 去离子水 DNA聚合酶 缓冲液 dNTP MgSO4(可选)和DMSO（可选）
PCR

1、若无条带：

（1）反应体系错误。重新配置反应体系确保各种试剂加入的量没有问题。

（2）PCR程序出错。检测PCR仪程序是否正确。

（3）DNA胶问题。DNA凝胶电泳时加入阳性对照。

（4）退火温度不合适。以2度为梯度设计梯度PCR反应优化退火温度。

（5）DNA模板量太少。增加DNA模板量。

（6）引物错误。利用BLAST检查引物特异性或重新设计引物。

（7）DNA模板中存在抑制剂。确保DNA模板干净

（8）模板有复杂结构。加入DMSO,BSA或者甜菜碱。可尝试递减PCR。

2、PCR产物量过少：

（1）延伸时间太短。以1kb/分钟的原则设置延伸时间。

（2）变性时间过长。变性时间过长会导致DNA聚合酶失活。