材料与仪器
培养细胞
DMEM HCl TBS Tris
微量离心管 Plexiglas盒 吸头 细胞刮子 冷冻离心机
DMEM HCl TBS Tris
微量离心管 Plexiglas盒 吸头 细胞刮子 冷冻离心机
步骤
1. 培养待标记的细胞至适当的生长期。
对于贴壁细胞:
2a. 吸去培养液,用37℃的含血清不加标记物的标记培养液洗尽残存的含磷酸盐培养液,吸尽该培养液。
3a. 加入预热的标记培养液,加入量为:0.5~1 ml/35 mm 培养皿,1~2 ml/50 mm 培养皿,或2~4ml/ 100 mm 培养皿。
对于非贴壁细胞:
2b. 1 800 g 离心1 min,吸去培养上清,细胞用含血清不加标记物的标记培养液重悬, 再次离心吸去堉养液。
3b. 每107细胞加入2 ml 标记培养基至适合大小的培养平皿。
4. 在Plexiglas 挡板后操作,使用配备塞有棉花分防气溶胶的傲量移液器加入32Pi至终浓度为0.1~2 mCi/ml。
5. 将培养皿置于预热的Plexiglas 盒中,并将金子置于培养箱中。
6. 标记结束时,将装有标记细胞的Plexiglas 盒移至冷室,放在Plexiglas 挡板后面。
对于贴壁细胞:
7a. 从Plexiglas 盒子中取出培养皿,用一次性的移液管吸尽标记培养液,培养液和吸头或吸管均作为同位素废物弃置。
8a. 用2~10 ml 冷TBS洗涤细胞2次,同步骤7吸尽并弃去放射性废物。
9a. 加适量裂解缓冲液,用橡皮细胞刮子擦刮下贴壁细胞,裂解物留在培养皿上,4℃放置20 min。用橡皮细胞刮子将贴壁细胞的裂解液移至培养皿边缘,并将裂解液移入带螺口盖的微量离心管中。
对于非贴壁细胞:
7b. 从Plexiglas 盒子中取出培养皿,将细胞移至带螺口盖的微量离心管中,1 800 g 离心1 min,回收细抱,吸尽培养液。
8b. 细胞用小体积的冷TBS重悬,移至带螺口盖微量离心管中,1 800 g 离心1 min,吸尽TBS。
9b. 毎107细胞用0.5~1 ml 适当的裂解缓冲液悬浮细胞,用一次性的巴斯德吸管轻轻混匀,4℃放置20 min。
10. 盖上管盖,于4℃ 26 000 g 离心30 min 澄清裂解液。
10. 盖上管盖,于4℃ 26 000 g 离心30 min 澄清裂解液。
11. 离心后,将上清(裂解物)移至新的离心管中,离心管和沉淀作为同位素污物处理。
12. 用凝胶电泳,免疫沉淀或蛋白质纯化方法,分析标记的裂解液,所有过程均在4℃适当屏蔽下进行。
12. 用凝胶电泳,免疫沉淀或蛋白质纯化方法,分析标记的裂解液,所有过程均在4℃适当屏蔽下进行。
来源:丁香实验