由于昆虫杆状病毒环状双链DNA基因组很大 (约 130kbp) ,而且对限制性内切酶都具有多个识别位点 ,因而不能用常规基因工程操作直接将外源基因导入到病毒基因组中。昆虫重组杆状病毒的获得通常要分为两步进行。第一步 ,把外源基因克隆进通用载体质粒中 ,使外源基因处于杆状病毒强启动子的控制之下 ,而且左右两侧被杆状病毒DNA序列所包围。这些侧翼序列对病毒复制是非必需的 ,但在第二步同源重组时能发挥作用。第二步 ,把这一重组质粒DNA与野生型病毒基因组DNA一起导入昆虫细胞 ,在细胞内通过同源重组把外源基因插入病毒基因组 (外源基因置换了位于两个侧翼序列之间的野生型病毒基因组基因 ,如多角体蛋白基因 ) ,通过特定的筛选方法和筛选标记 ,即可筛选出目的重组病毒。
杆状病毒
琼脂 牛血清
培养瓶 冻存管
1. 制备病毒上清的系列稀释液，该病毒上清获得自在无血清完全培养液中转染 pAC360 β-gal DNA的细胞。在含150 ug/ml X-gal 的琼脂糖顶层覆盖物下病毒形成蚀斑。
2. 当蚀斑形成后，用灭菌巴斯德吸管挑取一个分离较好的蓝色蚀斑，并将琼脂糖块移入 一支含有1 ml 无血清完全培养液的无菌试管中。在旋涡混合器上剧烈篱荡，并用无血清完全培养液制备10-1、10-2和10-3的系列稀释液。
3. 用含150 ug/ml X-gal 的琼脂糖顶层覆盖物蚀斑测定病毒（有助于发现重组子），重复蚀斑试验，直到获得纯的重组病毒贮液。
4. 用无菌吸管挑取一个纯的重组蚀斑，将琼脂糖块移入一含2.5x106 Sf9细胞和5 ml 完全培养液（含10%胎牛血清）的25 cm2 培养瓶中。于27℃温育4~5天直到大多数细胞被感染。
5. 确定病毒滴度（应在5x107~1x108 pfu/ml之间）。
6. 加入1 ml 该毒种贮液于一支1.5 ml 螺口冻存管中，于-80℃可长期保存，于4℃保存剩余的液体（标记为初代毒种液）。从初代毒种液中生产大批病毒贮液并滴定之。
构建外源基因稳定表达系统昆虫细胞由于体积大 ,形状较不规整 ,容易结团 ,加之病毒感染后细胞膨大 1.5倍左右 ,这些因子增加了昆虫细胞大规模培养的难度。目前已经建立的大规模昆虫细胞培养形式有（1）贴壁培养：贴壁培养又可分为滚瓶培养和微载体培养两种（2）悬浮培养：悬浮培养又可分为摇瓶和转瓶（3）固定化培养等：固定化培养是近来发展的一项昆虫细胞大规模培养新技术 ,对昆虫细胞而言具有两大优点 :可有效降低剪切力对细胞的伤害 ,同时细胞与培液可有效分离 ,简化了操作步骤 ,降低了染菌机率。它又可分为微囊化培养和堆积床法培养 ,其中堆积床法培养综合了各种培养法的优点 ,昆虫细胞贴壁生长在球状颗粒上 ,并在气升式反应器的降液区形成堆积床 ,而升液区则进行深层通气供氧。堆积床法由于可提供高培养表面 ,同时又能保证充足的供氧。
1. 杆状病毒是一类在自然界中专一性感染节肢动物的DNA病毒，病毒粒子呈杆状，基因组为双链环状DNA分子，DNA以超螺旋形式压缩包装在杆状衣壳内，大小在90——180 Kb之间。目前杆状病毒作为高效、安全的无公害生物虫剂广泛应用于害虫防治。
2. 大肠杆菌E .coli-昆虫细胞的穿梭载体筛选系统[10 ]E .coli-昆虫细胞穿梭载体 （bacmid）是迄今为止最为方便、快捷的重组杆状病毒筛选系统。Bacmid既能象质粒一样在E .coli中复制 ,亦能象病毒一样感染昆虫细胞。Bacmid为一包含有mini -F复制子、卡那霉素抗性筛选标记和细菌转座子Tn 7的靶序列attTn7e及LacZ片段的重组病毒。转移载体的作用在此被贡献质粒所取代。贡献质粒设计为含抗庆大霉素基因和多角体蛋白启动子控制的外源基因两侧分别为tn7的左臂和右臂。同时为了产生位点特异的转座 ,还需有一个辅助质粒 （该质粒为四环素抗性筛选标志 ）提供转座蛋白。因此 ,当将bacmid、贡献质粒、辅助质粒转化同一个菌株时 ,由辅助质粒产生的转座蛋白 ,将抗庆大霉素基因和多角体蛋白启动子控制的外源基因转座到bacmid的attTn7序列上 ,同时破坏了Lac -Z的阅读框架 ,这样只要将转化上述质粒的菌株在含卡那霉素、四环素、庆大霉素及X -gal和IPTG的LB培养基上筛选白斑即可得到复合Bacmid ,将复合Bac midDNA纯化后转染昆虫细胞 ,就得到了纯的重组病毒 ,在昆虫细胞中外源基因在多角体启动子的控制下进行表达。该系统是目前BEVS中最为方便、快捷的系统 ,整个重组病毒筛选的周期可缩短为 7- 10d ,且可以连续筛选 ,因此十分适合于cDNA文库的构建及蛋白质工程研究方面的应用。同时 ,贡献质粒亦较常规的重组转移载体为小 ,可以构筑较多的限制性酶切位点和进行改建 ,以利于外源基因的插入 ,且贡献载体不仅能适用于BEVS中 ,亦能适合在其它真核生物表达系统中进行转座 ,艺表达外源基因。由于转座的免疫性 ,可以防止外源基因的多次插入。不足之处在于只有 12 .5kb的外源基因插入多角体蛋白基因位点 ,而且 ,插入后可能破坏了多角体启动子工作环境 ,以致外源基因的表达量较之传统的同源重组纯化的重组病毒略有降低。
来源：丁香实验
