材料与仪器
昆虫细胞
胎牛血清 脂质体转染剂
培养皿 锥形瓶 培养箱 离心机 转子
胎牛血清 脂质体转染剂
培养皿 锥形瓶 培养箱 离心机 转子
步骤
1. 接种2x106个Sf9细胞于60 mm 培养皿,在含10%胎牛血清的完全培养液或无血清培养液中培养,于27℃培养30~60 min,让细胞贴壁。
2. 相应于毎一待转染的培养皿,吸取40 ul 无菌水,加入一支无菌聚苯乙烯管中,加入5 ul 线性化的AcMNPV DNA和5 ul 100 ng/ul 的质粒DNA。将Lipofectin 充分混匀后,往DNA溶液中加入50 ul,轻柔混匀,于室温温育15 min。
2. 相应于毎一待转染的培养皿,吸取40 ul 无菌水,加入一支无菌聚苯乙烯管中,加入5 ul 线性化的AcMNPV DNA和5 ul 100 ng/ul 的质粒DNA。将Lipofectin 充分混匀后,往DNA溶液中加入50 ul,轻柔混匀,于室温温育15 min。
3. 在15 min 的温育期间,用1.5 ml 不含胎牛血清的完全培养液代替培养皿中的培奍液。
4. 往培养皿中遂滴加入Lipofectin-DNA复合物,同时轻柔旋转平皿加以混匀。于27℃温育4~5 h。
5. 往每个培养皿中加入1.5 ml 含10%胎牛血清的完全培养液(或含有5%胎牛血清的无血清培养液),在27℃加湿培养箱中温育60~72 h。
6. 从每个堉养皿中将转染上清(由培养液和病毒组成)转移至无菌的15 ml 锥形离心管中4℃ 1 000 g 离心10 min。将病毒上清转移至新的灭菌试管,4℃避光保存备用。
来源:丁香实验