原理
高锰酸钾固定液能除掉细胞内的蛋白质成份，而保留膜的脂类成分，其结果，细胞骨架和细胞内可溶性蛋白质等被去除，增加了标本的透明度，同时内质网、线粒体、高尔基体、溶酶体等生物膜系统被完整地保存下来。高锰酸钾固定剂在固定标本的过程中，能形成二氧化锰，可在细胞的各种膜结构的脂类亲水端形成微细的沉淀，结果标本不需染色，即能在相差显微镜和透射电镜下清晰地显示细胞生物膜系统全貌。
材料与仪器
肾上皮细胞
高锰酸钾 秋水仙素 PBS Formvar液
显微镜 相差显微镜 透射电子显微镜 镍网 载玻片 盖玻片 培养皿 CO2培养箱
高锰酸钾 秋水仙素 PBS Formvar液
显微镜 相差显微镜 透射电子显微镜 镍网 载玻片 盖玻片 培养皿 CO2培养箱
步骤
一、高锰酸钾固定法显示用药（秋水仙素处理）前后CV-1细胞生物膜系统光镜标本的制备及观察。
1. 取无菌盖玻片，分别放入二个直径5 cm 的培养皿中，接种CV-1细胞，加3 ml 培养基。
2. 加盖做好标记，移入CO2培养箱培养24小时。其中一个培养皿在终止培养前4小时，加入10 ug/ml 秋水仙素0.3 ml。
3. 在倒置显微镜下观察选定长有铺展良好细胞的盖玻片，终止培养，倒掉培养液。
4. PBS液冲洗盖玻片二次，清除细胞表面的培养基和杂质。
5. 取出盖玻片，将长有铺展良好细胞的盖玻片，细胞面朝上放在载片上。
6. 滴新配制的高锰酸钾固定剂于盖玻片上，固定10分钟。
7. 蒸馏水轻轻地冲洗标本的细胞面5次，去除残留固定液。
8. 取下盖玻片，用滤纸吸干多余水份，滴1滴PBS液于载玻片上，将盖玻片附有细胞面朝下，装片。
二、高锰酸钾固定液显示用药（秋水仙素处理）前后CV-1细胞生物膜系统电镜标本的制备及观察。
1. 用0.5%Formvar液制做支持膜。
2. 将覆有Formvar膜的镍网经紫外线灯灭菌后，放入直径5 cm 的无菌培养皿中，加培养基3ml。
3. 接种CV-1细胞于铺有支持膜的镍网上，一组是不经药物处理的作为对照组，另一组是经10 ug/ml 秋水仙素处理的作为实验组。
4. 实验组的培养细胞在终止培养前4小时加入10 ug/ml 秋水仙素0.3 ml，放入CO2培养箱中进行细胞培养。
5. 待细胞铺展开后，取出镍网，用乳头吸管滴1滴高锰酸钾固定液于镍网上，固定细胞10分钟。
6. 经上升梯度乙醇系列脱水：30%→50%→70%→85%→90%→95%→100%，每次脱水3分钟。
7. 待镍网晾干后，在透射电子显微镜下（75 KV 电压）进行观察。
三、结果
1. 在光镜下和透射电子显微镜下，内质网呈网状铺展于整个细胞质内。
2. 细胞核周围的内质网形成较稠密三维结构，远离细胞核周围的内质网则呈松散的网状伸展至细胞边缘。
3. 在电镜下可见内质网由细管和扁囊构成。除内质网外，还可看到粗大的呈条索状的线粒体，也可观察到高尔基器和溶酶体等膜性结构。
4. CV-1细胞经秋水仙素处理后，其内质网向细胞核周围聚集，细胞边缘区域不再观察到内质网。
5. 秋水仙素破坏微管结构，因此，内质网的分布可能与微管的存在有密切关系。
来源：丁香实验
