DNA 和 RNA 靶序列的原位 PCR 扩增实验

1. 将载有固定样品的载玻片置105℃加热块上5~120 s。

2. 载玻片放入含0.3%H₂O₂中，于37℃或室温温育过夜，以灭活内源性过氧化物酶活性，然后以PBS洗1遍。

3. 取1 mg/ml 的蛋白酶K稀释于150 ml PBS（终浓度6 μg/ml），将玻片浸于此液中，室温温育5 min 后，400×显微镜下观察细胞，如多数待检细胞呈现小“圆泡”、 “斑点”或“胡椒粒”状，可马上进行步骤4操作。温育5 min 后，如未出现上述情形，亦可继续温育，时间可长至60 min，待细胞表面呈小气泡状时，及时进行步骤4。

4. 在95℃加热载玻片2 min 以灭活蛋白酶K。然后浸于PBS中10 s、水中10 s，再晾干载玻片。

5. 加10 μl 无RNA酶的DNA酶液至载玻片各样品上，放加湿盒中，于37℃温育过夜。

6. 用冲洗缓冲液洗片1次，然后以DEPC处理的水冼2次，晾干。

7a. 如使用AMV或MoMuLV 反转录酶：配置如下反转录体系（总体积20 μl）

（1）2 μl 10×AMV/MoMuLV RT缓冲液（1×）

（2）2 μl 10 mmol/l 4种dNTP混合液（终浓度1 mmol/l）

（3）0.5 μl 40 U/μl RNasin（终浓度1 U/μl）

（4）1.0 μl 20 μmol/l 下游行物（终浓度1 μmol/l）

（5）0.5 μl 20 U/μl AMV或MoMuLV 反转录酶（终浓度0.5 U/μl）

（6）8 μl DEPC处理过的水

7b. 如使用SuperScript 2反转录酶：配置如下反转录体系（总体积20 μl）

（1）4 μl 5×反应缓冲液（随酶提供：1×终浓度）

（2）2 μl 10 mmol/l 4dNTP混合液（终浓度 1 mmol/l）

（3）0.5 μl 4 U/μl RNasin（终浓度 0.1 U/μl）

（4）1.0 μl 20 mmol/l 下游引物（终浓度 1 μmol/l）

（5）0.5 μl 20 U/μl SuperScript 2（终浓度0.5 U/μl）

（6）1.2 μl 0.1 mol/l DTT（终浓度6 mmol/l）

（7）4.8 μl DEPC处理过的水

8. 加10 μl 反转录酶体系于载玻片各样品上，并小心盖上20 mm×60 mm 的盖玻片，放一加湿盒中，于42℃或37℃温育1 h。

9. 在92℃加热块上温育玻片2 min，移去盖玻片并用水洗玻片2次。

10. 配置如下扩增体系（总体积100 μl）

（1）5 μl 25 μmol/l 正向引物（终浓度1.25 μmol/l）

（2）5 μl 25 μmol/l 反向引物（终浓度1.25 μmol/l）

（3）2.5 μl 10 mmol/l 4dNTP混合物（每种dNTP终浓度200 μmol/l）

（4）1.0 μl 1.0 mol/l Tris·Cl，pH8.3（终浓度10 mmol/l）

（5）5.0 μl 1.0 mol/l KCl（终浓度50 mmol/l）

（6）2.5 μl 100 mmol/l MgCl₂（终浓度2.5 mmol/l）

（7）10 μl 0.01%明胶（终浓度0.001%）

（8）2 μl 5 U/μl Taq DNA聚合酶（终浓度0.1 U/μl）

（9）66 μl 水